尹美玲,段麗琴*,宋金明,袁華茂,李學(xué)剛

藿類生物標(biāo)志物及其對海洋碳氮循環(huán)過程的指示

尹美玲1,2,3,4,段麗琴1,2,3,4*,宋金明1,2,3,4,袁華茂1,2,3,4,李學(xué)剛1,2,3,4

(1.中國科學(xué)院海洋研究所,海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室,山東 青島 266071；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室,山東 青島 266237；4.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

由微生物介導(dǎo)的海洋碳氮生物地球化學(xué)循環(huán)對全球氣候變化具有重要影響.五環(huán)三萜的藿類化合物(hopanoids),包括以細(xì)菌藿多醇(BHPs)為主的生物藿類和藿烷等地質(zhì)藿類,是指示近現(xiàn)代環(huán)境和重建古環(huán)境中碳氮循環(huán)過程的重要類脂生物標(biāo)志物.本文總結(jié)了藿類化合物的生物合成途徑和生理功能,及在海洋碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程(固氮、硝化、厭氧氨氧化、甲烷氧化和陸源有機(jī)質(zhì)輸入)中的指示作用.微生物膜脂中的藿類化合物主要由基因編碼的藿類合成和修飾酶調(diào)控,與微生物理化特征及環(huán)境條件具有密切關(guān)系.2-甲基藿類、2-甲基環(huán)醇醚和不飽和環(huán)醇醚等藿類化合物可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的氧滲透性以發(fā)揮固氮酶保護(hù)作用,可指示環(huán)境中固氮藍(lán)細(xì)菌及其固氮過程.細(xì)菌藿四醇異構(gòu)體之一的BHT-x是海洋厭氧氨氧化菌的專屬產(chǎn)物,可指示海洋厭氧氨氧化和低氧環(huán)境.土壤標(biāo)志物BHPs及陸源輸入指標(biāo)soil可追蹤陸源有機(jī)質(zhì)向海洋環(huán)境的輸入和遷移.35-氨基BHPs和3-甲基(氨基)BHPs可指示好氧甲烷氧化活動.細(xì)菌藿六醇和3-甲基細(xì)菌藿六醇可指示亞硝酸鹽型甲烷氧化活動.未來,隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和儀器分析技術(shù)的不斷發(fā)展,藿類化合物在指示海洋碳氮循環(huán)過程方面勢必會發(fā)揮更加重要的作用.

藿類化合物；細(xì)菌藿多醇(BHPs)；海洋氮循環(huán)；好氧甲烷氧化；生物標(biāo)志物

碳、氮循環(huán)是生物地球化學(xué)過程的關(guān)鍵,對海陸物質(zhì)循環(huán)和全球氣候變化具有重要影響.海洋碳、氮生物地球化學(xué)過程均由特定的微生物驅(qū)動,一些微生物在生物化學(xué)過程中可產(chǎn)生藿類(hopanoids)等類脂化合物[1].藿類化合物是地質(zhì)體中普遍存在、保存穩(wěn)定的五環(huán)三萜化合物,由于其具有細(xì)菌來源專屬性和環(huán)境特異性,可指示生物來源并記錄沉積環(huán)境演變信息,在反演海洋碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程方面發(fā)揮重要作用[2].藿類化合物包括以細(xì)菌藿多醇(BHPs)為主的生物藿類和藿烷、藿酸、藿烯等地質(zhì)藿類(表1),其中BHPs是地質(zhì)藿類的前體物質(zhì),在成巖作用中脫去部分側(cè)鏈結(jié)構(gòu)保留穩(wěn)定的碳骨架而形成地質(zhì)藿類化合物[2-3].在微生物學(xué)和生物地球化學(xué)領(lǐng)域,通常所說的藿類脂質(zhì)主要指微生物參與合成的生物藿類BHPs[4-5].BHPs具有五環(huán)三萜碳骨架和多結(jié)構(gòu)的官能基團(tuán)側(cè)鏈,在微生物體內(nèi)的合成過程主要由基因編碼的藿類合成和修飾酶調(diào)控.微生物在角鯊烯-藿烯環(huán)化酶(SHC)的作用下合成C30里白烯或里白醇,并經(jīng)過S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)自由基酶(HpnH)、磷酸化酶(HpnG)和氨基轉(zhuǎn)移酶(HpnO)等酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化成具有多官能化極性側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的BHPs[5-7].

表1 環(huán)境中常見的BHPs和地質(zhì)藿類種類與來源[3]

早期發(fā)現(xiàn)的藿類化合物主要是高等植物來源的不飽和藿類(如里白烯),以及廣泛存在于地質(zhì)體巖石和石油中的藿烷及其衍生物,這些地質(zhì)藿類分子化石及其相關(guān)參數(shù)最早被成功應(yīng)用于石油地球化學(xué)勘探,成為油氣運移和有機(jī)質(zhì)成熟度的重要判別指標(biāo)[8].直到1973年從一株醋酸菌中分離并檢測到細(xì)菌藿四醇(BHT),人們才逐漸認(rèn)識和研究這類細(xì)菌來源的生物藿類BHPs.藍(lán)細(xì)菌、變形菌等原核生物膜脂中的BHPs被認(rèn)為與真核生物膜中固醇類化合物的作用相似,在維持和調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性、滲透性及流動性方面具有重要作用[6,9].近20年來,得益于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、同位素質(zhì)譜等儀器和分析技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展,多結(jié)構(gòu)的藿類分子不斷被鑒定和發(fā)現(xiàn),藿類化合物在生物地球化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷拓展[10-11].一些藿類化合物側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)差異包含了特定的生物和環(huán)境信息,在指示生物來源、生物過程以及沉積環(huán)境方面發(fā)揮重要作用.如2-甲基藿類通常作為藍(lán)細(xì)菌和固氮貢獻(xiàn)的生物標(biāo)志物[12];3-甲基藿類主要來源于好氧甲烷氧化菌和醋酸菌[13],其中35-氨基BHPs(氨基藿三醇、氨基藿四醇和氨基藿五醇)是好氧甲烷氧化菌和好氧甲烷氧化過程的生物標(biāo)志物[14-15];來源于海洋厭氧氨氧化菌的BHT異構(gòu)體(BHT-isomer)與海洋低氧條件密切相關(guān),對厭氧氨氧化過程和低氧環(huán)境具有較大的指示潛力[16-17].

然而,目前環(huán)境中藿類化合物的生物來源專屬性還存在一些不確定性.基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的最新研究表明,雖然藿類合成基因廣泛存在于非異形胞分化的固氮藍(lán)細(xì)菌中,但并不是所有的固氮藍(lán)細(xì)菌均可以產(chǎn)生2-甲基藿類[18];某些其他菌群也具有C-2甲基化基因,如沼澤紅假單胞菌TIE-1[19].可能最早起源于需氧微生物的祖先—ɑ-變形菌,即2-甲基藿類的存在可能早于藍(lán)細(xì)菌光合作用的發(fā)生[20].實驗室研究已表明,溫度、pH值、鹽度、溶解氧等多種環(huán)境條件均會影響微生物生理特征及藿類合成,且不同微生物合成的不同藿類對環(huán)境壓力的調(diào)節(jié)作用具有差異[21-23];但關(guān)于藿類合成基因選擇性表達(dá)以應(yīng)對環(huán)境脅迫的響應(yīng)機(jī)制的研究還有待深入探索.本文總結(jié)了藿類化合物的生物合成途徑及其生理功能,分析了藿類生物標(biāo)志物在固氮、硝化、厭氧氨氧化和甲烷氧化等海洋碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程中的生成機(jī)理及指示作用.未來,隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和分析鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展,藿類化合物在指示碳氮循環(huán)過程方面勢必會發(fā)揮更重要的作用.

圖1 藿類化合物的生物合成過程[5-7]

1 藿類化合物的生物合成與生理功能

藿類化合物的生物合成主要由微生物基因編碼的藿類合成和修飾酶調(diào)控(圖1).五環(huán)三萜藿類化合物的生物合成首先開始于角鯊烯的形成.角鯊烯是環(huán)狀三萜的母體分子,由兩個支鏈的法尼基二磷酸經(jīng)3種角鯊烯合成酶(類角鯊烯合成酶(HpnD)、類角鯊烯合成酶(HpnC)和氨基氧化還原酶(HpnE))共同催化合成[24].微生物在藿類合成酶SHC的作用下,將支鏈的角鯊烯經(jīng)非氧氣參與過程環(huán)化形成藿類化合物—C30里白烯或里白醇[25-26].微生物宏基因組研究表明,大約10%的細(xì)菌具有編碼藿類合成酶SHC的基因,包括變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)等,它們廣泛分布在沉積物、湖泊和海洋環(huán)境中[27].

微生物中C30藿類化合物向BHPs轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由HpnH催化的酶促反應(yīng),將5'-脫氧腺苷自由基(5'-dA?)與C30里白烯結(jié)合,合成C35BHPs的基本骨架[28-29].SAM帶有一個活化的甲基,可以作為一種輔酶參與合成和分解代謝中的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng),將活化甲基轉(zhuǎn)移到核酸、蛋白質(zhì)等底物中[18].另一方面,SAM還可以被SAM自由基酶活性位點上的[4Fe-4S]+團(tuán)簇還原裂解,形成5'-dA?,從而引發(fā)多種自由基反應(yīng)[30].HpnH幾乎存在于所有產(chǎn)生藿類化合物的微生物中[28].Sato等[5]通過鏈霉菌的酶體外實驗進(jìn)一步驗證了HpnH催化下自由基反應(yīng)形成C35BHPs中間體—腺苷藿烷的生物合成機(jī)理.SAM還原裂解后的5'-dA?與里白烯的末端雙鍵進(jìn)行自由基加成反應(yīng),在5'-dA?的C-5'與里白烯的C-29之間形成碳碳單鍵,將腺苷基團(tuán)側(cè)鏈與C30里白烯結(jié)合從而合成22(R)-腺苷藿烷.

C35BHPs的基本骨架形成后,可以被微生物體內(nèi)的其他基因轉(zhuǎn)化合成多樣化的側(cè)鏈結(jié)構(gòu).盡管目前對于不同BHPs側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的合成過程及其環(huán)境適應(yīng)還了解不足,但基因的表達(dá)會受到微生物種類和環(huán)境條件的調(diào)控[6,31].腺苷藿烷可以在參與藿類合成的HpnG作用下去除腺嘌呤,生成具有核糖側(cè)鏈的核糖藿烷;核糖藿烷作為腺苷藿烷合成多種BHPs結(jié)構(gòu)的中間體,其核糖側(cè)鏈可打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)并在未知酶的催化下形成C35BHT[7,32].BHT及其他藿類化合物在C-2甲基轉(zhuǎn)移酶(HpnP)和C-3甲基化酶(HpnR)的作用下可以形成C-2或C-3位置甲基化的藿類化合物[19,33].此外,BHT還可以被參與藿類合成的酶HpnO,HpnJ,HpnI和HpnK調(diào)控,依次合成氨基三醇,BHT環(huán)醇醚,N-乙?；腂HT葡萄糖胺和BHT葡萄糖胺[34].

藿類化合物作為原核生物膜脂的重要組分,在微生物膜中的結(jié)構(gòu)和分布與微生物理化特征及環(huán)境條件具有密切關(guān)系.藿類化合物廣泛存在于微生物胞內(nèi)膜、胞外膜、孢子膜、囊泡膜等多種膜結(jié)構(gòu)中,在微生物膜中所占比例差異較大,由<1%至90%不等[35-36].由于藿類化合物具有極性的側(cè)鏈基團(tuán)和疏水的環(huán)狀結(jié)構(gòu),可以插入微生物雙層膜脂中并與其他膜脂分子相互作用,從而改變微生物膜的理化特征[9,37].具體來說,原核生物膜脂中的藿類化合物可以影響生物膜的流動性和滲透性,使生物膜結(jié)構(gòu)緊密,強(qiáng)度增加,并不同程度地降低膜滲透性[6].盡管目前的研究證據(jù)還較少,但藿類化合物可與膜脂中脂質(zhì)相互作用,促進(jìn)形成結(jié)構(gòu)致密的有序液體區(qū)域—脂筏[37-38],從而在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)、通道蛋白等過程中具有不可或缺的作用[6].此外,微生物膜中藿類化合物受到細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控,有助于提高微生物在高溫、低pH值、高滲透壓等逆境脅迫時的抗逆性,在調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[22,39].不同種類微生物所合成的不同藿類化合物對環(huán)境壓力的響應(yīng)具有差異.例如,嗜熱嗜酸芽孢桿菌合成的BHPs含量隨環(huán)境溫度升高而增加,隨pH值降低而略有增加[40];甲基單胞菌屬的耐冷菌株合成的藿類化合物含量則隨著環(huán)境溫度升高而下降[41].2-甲基藿類通常與微生物的低pH值脅迫有關(guān).當(dāng)環(huán)境pH值降低時,細(xì)胞膜脂中2-甲基藿類含量增加,從而降低細(xì)胞膜的滲透性,阻止陽離子和質(zhì)子的擴(kuò)散[23].

2 2-甲基藿類生物標(biāo)志物對固氮過程的指示

2.1 2-甲基藿類化合物

生物固氮作用通過固氮酶將N2還原為生物有效態(tài)氮,是海洋環(huán)境中提供氮源,維持初級生產(chǎn)力和新生產(chǎn)力的重要過程.海洋中的固氮生物包括藍(lán)細(xì)菌、異養(yǎng)細(xì)菌、光合細(xì)菌和單細(xì)胞固氮藍(lán)藻等,其中固氮藍(lán)細(xì)菌是主要的固氮生物,僅束毛藻屬(sp.)的固氮量就達(dá)到87.4Tg/a,占海洋總固氮量的36%[42-43].固氮生物的固氮酶體系是由多種蛋白組成的復(fù)合體,以含鉬固氮酶,含釩固氮酶和含鐵固氮酶為作用中心[44].含釩固氮酶和含鐵固氮酶只在缺乏鉬離子時表達(dá),分別由和基因編碼;組成含鉬固氮酶的鐵蛋白和ɑ、?鉬鐵蛋白結(jié)構(gòu)分別由、,基因編碼[45].由于編碼鐵蛋白的基因在不同固氮微生物中廣泛存在并具有高度保守性,且攜帶的功能信息比其他序列更加豐富,因而通常作為環(huán)境中固氮生物多樣性的分析依據(jù)[44].

藍(lán)細(xì)菌是環(huán)境中重要的藿類化合物來源,它不僅可以合成BHT和氨基藿三醇等非來源特異性的BHPs,還可以合成來源特異性的2-甲基BHPs[46].2-甲基BHPs廣泛存在于沉積物和實驗室培養(yǎng)的藍(lán)細(xì)菌中,通常作為藍(lán)細(xì)菌的生物標(biāo)志物用以反映近現(xiàn)代沉積物和古環(huán)境中藍(lán)細(xì)菌的生物量及光合作用進(jìn)程[12,47].雖然海洋中具有固氮作用的藍(lán)細(xì)菌只占到總藍(lán)細(xì)菌量的一小部分,但這些固氮藍(lán)細(xì)菌卻對海洋固氮和氮循環(huán)具有重要作用[48].因此2-甲基藿類化合物指數(shù)(2-MeHI=2-甲基藿類化合物/總藿類化合物×100%)可用于指示海洋藍(lán)細(xì)菌的固氮強(qiáng)度和貢獻(xiàn)[49].中生代海洋缺氧事件(OAEs)和其他歷史時期沉積物中2-甲基藿類化合物豐度的增加,被認(rèn)為是該時期海洋固氮藍(lán)細(xì)菌繁殖和海洋固氮作用增強(qiáng)的結(jié)果[49-50].

微生物在HpnP的催化作用下合成A環(huán)2號碳位置甲基化的2-甲基BHPs(圖1),而后在地質(zhì)過程中經(jīng)氧化和成巖作用脫去側(cè)鏈基團(tuán)形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的2-甲基藿烷等地質(zhì)藿類化合物(圖2).目前已在固氮藍(lán)細(xì)菌束毛藻屬(sp.),藍(lán)絲藻屬(spp.),眉藻屬(sp.)和單細(xì)胞固氮藍(lán)藻瓦氏鱷球藻(spp.)等多種主要的固氮藍(lán)細(xì)菌中檢測到基因[33],進(jìn)一步證明2-甲基藿類化合物作為固氮藍(lán)細(xì)菌生物標(biāo)志物的潛力.然而,基因組學(xué)的最新研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)藍(lán)細(xì)菌同時具有和基因序列,是可以合成2-甲基藿類的固氮藍(lán)細(xì)菌;但并不是所有的固氮藍(lán)細(xì)菌均具有基因,具有基因序列的藍(lán)細(xì)菌只占到已測序藍(lán)細(xì)菌的13%[18,31].其他細(xì)菌菌群中也檢測到基因序列,例如沼澤紅假單胞菌TIE-1[19],甲基桿菌屬(spp.)[51]和土壤慢生根瘤菌屬(spp.)[52].這些證據(jù)表明,目前環(huán)境中2-甲基藿類化合物的潛在微生物來源并不局限于藍(lán)細(xì)菌,其作為固氮藍(lán)細(xì)菌的生物標(biāo)志物具有復(fù)雜性和不確定性,需要謹(jǐn)慎應(yīng)用.

2.2 藿類化合物的固氮酶保護(hù)作用

固氮藍(lán)細(xì)菌的固氮酶對氧含量極其敏感,高氧環(huán)境對固氮酶具有抑制作用[53].那么進(jìn)行產(chǎn)氧光合作用的固氮藍(lán)細(xì)菌是如何在開放環(huán)境中維持細(xì)胞內(nèi)缺氧水平從而保護(hù)固氮酶活性呢?固氮藍(lán)細(xì)菌具有獨特的保護(hù)固氮酶機(jī)制.一部分固氮藍(lán)細(xì)菌(如絲狀藍(lán)細(xì)菌)會分化形成進(jìn)行固氮作用的異形胞.異形胞內(nèi)缺乏產(chǎn)氧光合系統(tǒng)Ⅱ(PSII),具有高的脫氫酶、氫化酶和超氧化物歧化酶活力,以及較高的呼吸強(qiáng)度,這些特性使異形胞內(nèi)保持高度的無氧或還原狀態(tài)從而保護(hù)固氮酶的活性[33,54].沒有異形胞分化的藍(lán)細(xì)菌則會將固氮作用與光合作用在空間和時間上分開進(jìn)行,如束毛藻和瓦氏鱷球藻;或者通過提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶和超氧化物歧化酶活力以保護(hù)固氮酶[54-55].

但上述固氮酶保護(hù)機(jī)制都不能消除環(huán)境中氧氣通過生物膜擴(kuò)散所產(chǎn)生的影響.藿類化合物分子可通過在細(xì)胞膜上的分布調(diào)節(jié)膜穩(wěn)態(tài),其疏水結(jié)構(gòu)嵌入雙層生物膜脂以降低細(xì)胞膜對氧氣的滲透性[6,56],因此藿類化合物可能在藍(lán)細(xì)菌固氮作用中發(fā)揮重要作用.Cornejo-Castillo等[33]對所有已知基因組的海洋藍(lán)細(xì)菌中藿類合成基因進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,非異形胞分化的海洋藍(lán)細(xì)菌中普遍存在編碼藿類合成酶SHC的基因,例如固氮藍(lán)細(xì)菌束毛藻屬,藍(lán)絲藻屬和單細(xì)胞固氮藍(lán)細(xì)菌UCYN-A;而海洋中主要的非固氮藍(lán)細(xì)菌聚球藻屬(spp.)和原綠球藻屬(spp.),以及分化異形胞的固氮眉藻屬和植生藻屬(sp.)中均不具有藿類合成基因.該研究表明,生物膜脂中的藿類化合物作為非異形胞分化的海洋固氮藍(lán)細(xì)菌所獨有的一種固氮酶保護(hù)機(jī)制,通過降低細(xì)胞膜對氧氣的滲透性,限制膜外氧氣擴(kuò)散,從而維持固氮酶所需的缺氧環(huán)境.此外,在瓦氏鱷球藻和藍(lán)絲藻屬中,藿類合成酶基因的轉(zhuǎn)錄在固氮酶基因轉(zhuǎn)錄水平增加之前達(dá)到峰值[57].陸源固氮菌弗蘭克氏菌屬(sp.)中,發(fā)生固氮作用的囊泡中的藿類化合物具有限制氧氣擴(kuò)散的作用,且囊泡胞膜厚度與胞外氧氣濃度具有直接關(guān)系[58].這些研究證據(jù)均證明了生物膜脂中的藿類化合物在固氮細(xì)菌中的酶保護(hù)作用.

2.3 固氮藍(lán)細(xì)菌的其他生物標(biāo)志物

除2-甲基BHPs外,還有一些BHPs組分對固氮藍(lán)細(xì)菌的某些屬種具有來源專一性,可以作為環(huán)境中來源藍(lán)細(xì)菌的良好生物標(biāo)志物.C-6或C-11位置不飽和的BHT環(huán)醇醚主要由束毛藻屬合成[59].雖然在醋酸菌和伯克氏菌中也發(fā)現(xiàn)了不飽和BHT環(huán)醇醚,但由于這兩種細(xì)菌幾乎不存在于開放的海洋環(huán)境中,因此不飽和的BHT環(huán)醇醚可作為海洋環(huán)境中束毛藻的生物標(biāo)志物,用以指示其生物量及對氮循環(huán)的影響[60].2-甲基環(huán)醇醚被證明僅由組囊藻屬(sp.)產(chǎn)生[61];細(xì)菌藿五醇則來源于藍(lán)細(xì)菌的念珠藻屬(sp.)[59].

對于分化有異形胞的固氮藍(lán)細(xì)菌,厚密的異形壁通過阻止氧氣擴(kuò)散入異形胞內(nèi)來保護(hù)固氮酶.異形胞糖脂是異形胞壁包被層的主要組分,可以在沉積環(huán)境中穩(wěn)定保存,因此通常被作為異形胞固氮藍(lán)細(xì)菌特有的生物標(biāo)志物[4,62].異形胞糖脂由糖基(六碳糖或五碳糖)與C26～C32的長鏈二醇、三醇、酮醇或酮二醇連接組成(圖2),不同的異形胞糖脂結(jié)構(gòu)來源于不同種類的異形胞藍(lán)細(xì)菌,所以異形胞糖脂還可用于指示藍(lán)細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu).例如,膠須藻科()目前被證實主要合成C28的糖脂三醇和糖脂酮醇[63];與硅藻共生的異形胞藍(lán)細(xì)菌則主要合成具有五碳糖的糖脂結(jié)構(gòu)[62].

3 藿類生物標(biāo)志物對硝化過程的指示

固氮生物固定的有效態(tài)氮通過硝化過程在NH4+、NO2-和NO3-之間進(jìn)行氧化還原轉(zhuǎn)化.作為重要的氮循環(huán)過程之一,硝化反應(yīng)包括氨氧化(NH4+被氧化為N2O和NO2-)和亞硝酸鹽氧化(NO2-被氧化為NO3-)兩個過程,其中氨氧化過程由氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)參與,亞硝酸鹽氧化過程主要由亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)參與.目前研究認(rèn)為,AOA主要屬于奇古菌門(Thaumarchaeota.泉古菌醇(crenarchaeol)作為僅由奇古菌產(chǎn)生的一種甘油二烷基甘油四醚(GDGTs),可較好的指示氨氧化古菌參與的氨氧化過程[4].而AOB通常產(chǎn)生非來源特異性的氨基藿三醇、里白烯和不飽和脂肪酸等,運用特定的生物標(biāo)志物來識別細(xì)菌氨氧化過程還存在困難[65].NOB主要包括硝化桿菌屬(spp.),硝化球菌屬(spp.),硝化刺菌屬(spp.)和硝化螺菌屬(spp.)四個屬.在硝化螺菌屬中鑒定出一種特異性的脂肪酸—11-甲基十六烷酸后,該脂肪酸常用于指示硝化螺菌屬及其硝化活動[66].然而,由于脂肪酸較易受到成巖作用的降解,在百萬年以上的古沉積物中難以發(fā)揮分子標(biāo)志物作用[4].

Elling等[18]研究發(fā)現(xiàn),NOB的硝化桿菌屬可以合成2-甲基藿類化合物,并利用2-甲基藿類作為亞硝酸鹽氧化過程的生物標(biāo)志物解釋了地質(zhì)歷史時期的海洋氮循環(huán)變化,為生物標(biāo)志物反演硝化過程提供了新思路.硝化桿菌屬產(chǎn)生2-甲基藿類的生物合成機(jī)制需要鈷胺素的參與.首先,一個SAM將其活化甲基轉(zhuǎn)移到鈷胺素而形成甲基鈷胺;另一個SAM還原裂解形成5'-dA?,5'-dA?與藿類化合物C-2位置的H原子結(jié)合而形成5'-dAH和藿類C-2位置自由基中間體.隨后,藿類化合物C-2位置自由基中間體攻擊甲基鈷胺的甲基部分,形成2-甲基藿類化合物.然而,已測序的硝化桿菌屬均缺乏完整的鈷胺素生物合成途徑,但AOA卻是鈷胺素的重要來源微生物[67].基于鈷胺素生產(chǎn)者AOA和鈷胺素缺乏體NOB的共同生態(tài)位,Elling等[18]認(rèn)為NOB的硝化桿菌屬從同生態(tài)位的AOA中獲得生物體所必須的鈷胺素組分,二者形成協(xié)同促進(jìn)硝化過程的共生機(jī)制.

海洋碳氮循環(huán)示意圖改編自文獻(xiàn)[64],其中數(shù)字代表相應(yīng)的微生物過程,實線箭頭代表氮循環(huán)過程,虛線箭頭代表陸源有機(jī)質(zhì)輸入和甲烷氧化過程.4藿類生物標(biāo)志物對脫氮過程的指示

4 藿類生物標(biāo)志物對脫氮過程的指示

4.1 微生物厭氧氨氧化作用

全球海洋中低氧區(qū)不斷擴(kuò)大是海洋生態(tài)變化的總體趨勢.厭氧氨氧化過程對海洋脫氮的貢獻(xiàn)也隨之增強(qiáng),銨鹽等生物可利用性氮的減少又會反饋到海洋初級生產(chǎn)力和固碳的降低,從而影響海洋碳循環(huán)[4].因此,了解和研究海洋尤其是低缺氧海域中的厭氧氨氧化變化對海洋碳氮循環(huán)具有重要意義.

厭氧氨氧化菌廣泛存在于海洋沉積物、低缺氧水柱、泥炭土壤、陸地淡水等環(huán)境中,在嚴(yán)格低缺氧條件下,以CO2和CO32-作為碳源,NO2-為電子受體,將NH4+氧化為N2.研究表明,在氧氣濃度高于大約20 μmol/L時,厭氧氨氧化活動將受到明顯抑制[68].目前已知的厭氧氨氧化菌有6個屬,包括()、、、、和,它們同屬于浮霉?fàn)罹康膮捬醢毖趸?其中是海洋環(huán)境中最主要的厭氧氨氧化菌,其余5個屬均為淡水厭氧氨氧化菌[69-70].厭氧氨氧化菌最主要的特點是細(xì)胞分室,包括厭氧氨氧化體、核糖細(xì)胞質(zhì)及外室細(xì)胞質(zhì)3個部分,其中厭氧氨氧化體在細(xì)胞內(nèi)高度折疊,體積占到總細(xì)胞體積的50%～80%,是進(jìn)行厭氧氨氧化活動的場所[71].

van de Graaf等[72]通過15N同位素示蹤法研究了微生物體內(nèi)厭氧氨氧化的代謝過程首先NO2-在亞硝酸鹽還原酶(NiR)的作用下被還原為羥胺 (NH2OH),NH2OH和NH4+共同在聯(lián)胺水解酶(HH)的作用下形成聯(lián)胺(又稱為肼,N2H4).N2H4通過聯(lián)胺氧化還原酶(HZO)生成N2,并伴隨著４個質(zhì)子和４個電子產(chǎn)生.這4個電子與來自核糖質(zhì)中的5個質(zhì)子又通過NiR將NO2-還原為NH2OH,使厭氧氨氧化代謝過程循環(huán)進(jìn)行.在厭氧氨氧化代謝過程中,通過核糖質(zhì)中的質(zhì)子消耗和厭氧氨氧化體內(nèi)的質(zhì)子產(chǎn)生,在厭氧氨氧化體和核糖質(zhì)之間形成電化學(xué)梯度,因此維持膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度是厭氧氨氧化代謝過程的重要環(huán)節(jié)[71].厭氧氨氧化體膜脂的主要成分是由3個或5個線性順式連接的四元環(huán)和烷基鏈所組成的酯類結(jié)構(gòu)—梯烷脂(ladderane)(圖2).梯烷脂具有致密和相對不滲透性,能夠有效阻止小分子物質(zhì)的擴(kuò)散,保持膜兩側(cè)質(zhì)子的電化學(xué)梯度,且可以避免有毒小分子中間產(chǎn)物聯(lián)胺N2H4對其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)的毒害作用[73-74].因此,作為厭氧氨氧化菌一種獨特的膜脂結(jié)構(gòu),梯烷脂通常可用于指示環(huán)境中的厭氧氨氧化菌群生物量和厭氧氨氧化強(qiáng)度[4,75].

4.2 生物標(biāo)志物BHT異構(gòu)體

梯烷脂的四元環(huán)和烷基鏈結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,使其受成巖作用的影響較大,在反演長時間尺度古沉積環(huán)境中的厭氧氨氧化過程方面具有局限性[76].近年來在海洋厭氧氨氧化菌中發(fā)現(xiàn)了另一種特異性膜脂組分—BHT的立體異構(gòu)體(BHT- isomer).鑒于Rush等[77]在距今2.97百萬年的上新世腐泥中仍檢測到BHT異構(gòu)體的存在,因此BHT異構(gòu)體作為厭氧氨氧化菌的生物標(biāo)志物可以填補(bǔ)長時間尺度古環(huán)境中厭氧氨氧化反演的空白.此外,在阿拉伯海、卡利亞科盆地、智利北部和東海等海域的低缺氧水柱和沉積物中檢測到BHT異構(gòu)體,且BHT異構(gòu)體相對含量[BHT異構(gòu)體/(BHT異構(gòu)體+BHT)]與溶解氧濃度具有良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系,所以BHT異構(gòu)體還可以作為低氧指示指標(biāo)來示蹤海洋低缺氧狀況[16-17,78].

微生物在未知酶的催化下合成的BHT及異構(gòu)體,是在C-32至C-35上具有四個羥基的四官能化BHPs(圖2).相較于環(huán)境中存在廣泛、豐度高的BHT,BHT異構(gòu)體的分布和豐度則較少.目前已鑒定的BHT及異構(gòu)體結(jié)構(gòu)包括5種,分別是BHT-34S(17β,21β(H),22R,32R,33R,34S)、BHT-34R(17β,21β(H),22R,32R,33R,34R)、BHT-22S-34S(17β,21β(H),22S,32R,33R,34S)、BHT-17α-34S(17α,21β(H),22R,32R,33R,34S)和BHT-17α-34R(BHT-17α,21β(H),22R,32R,33R,34R),還有一種未知立體結(jié)構(gòu)的BHT-x[79].繼在阿拉伯海、卡里亞科盆地和秘魯?shù)脱跛w懸浮顆粒物中檢測到晚于BHT洗脫的BHT異構(gòu)體后,Rush等[80]首次在培養(yǎng)的海洋厭氧氨氧化菌中檢測出BHT異構(gòu)體,證明了BHT異構(gòu)體與厭氧氨氧化菌的特異性關(guān)系.最新研究表明,利用乙?；疊HT的氣相色譜(GC)結(jié)合非乙酰化BHT的超高效液相色譜(UHPLC)分析,可以識別出中的BHT異構(gòu)體為未知立體結(jié)構(gòu)的BHT-x,且為BHT-x目前已知的唯一微生物來源[79],即BHT-x可作為海洋厭氧氨氧化菌的特異性生物標(biāo)志物.而傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)檢測到的BHT異構(gòu)體包括BHT-x和BHT-34R兩種異構(gòu)體的共洗脫.其中,目前已知BHT-x僅來源于海洋厭氧氨氧化菌,而BHT-34R由多種陸地細(xì)菌產(chǎn)生,包括醋酸菌和[81],固氮菌弗蘭克氏菌屬(spp.)[82],II型甲烷營養(yǎng)細(xì)菌[15]和淡水厭氧氨氧化菌[79].鑒于外海海洋環(huán)境中的BHT及其異構(gòu)體主要來源于海洋細(xì)菌的原位產(chǎn)生,因而一般可認(rèn)為外海海洋環(huán)境中共洗脫的BHT異構(gòu)體主要為來源于海洋厭氧氨氧化菌的BHT-x[83].

5 藿類生物標(biāo)志物對陸源有機(jī)質(zhì)遷移過程的指示

全球海洋中約有80%以上的沉積有機(jī)質(zhì)埋藏在邊緣海中,包括海洋自生有機(jī)質(zhì)和陸源輸送的有機(jī)質(zhì),是生物地球化學(xué)循環(huán)中的巨大碳庫[84].準(zhǔn)確識別邊緣海中沉積有機(jī)質(zhì)的來源和遷移過程,對了解海洋碳匯潛力和全球碳循環(huán)具有重要意義.研究發(fā)現(xiàn),腺苷藿烷、腺苷藿烷-II、腺苷藿烷-III以及它們的2-甲基同系物對陸源土壤細(xì)菌具有高度來源專屬性(圖2).其中,腺苷藿烷和2-甲基腺苷藿烷由紫色非硫細(xì)菌、亞硝化單胞菌和根瘤菌產(chǎn)生,腺苷藿烷-II主要來源于紫色非硫細(xì)菌[3,85].它們被作為一組“土壤標(biāo)志物BHPs(soil marker BHPs)”,已成功應(yīng)用于追蹤陸源土壤有機(jī)質(zhì)向水生環(huán)境的輸入和遷移[86-88].此外,基于土壤標(biāo)志物BHPs和海洋來源BHT相對含量定義的陸源輸入指標(biāo)soil(soil= soil marker BHPs/(soil marker BHPs + BHT)),可有效指示海洋沉積有機(jī)質(zhì)中有機(jī)質(zhì)的來源及貢獻(xiàn)比例[83,89-90]. Wagner等[89]利用土壤標(biāo)志物BHPs及其soil指標(biāo)追蹤了亞馬遜河口近600年的陸源有機(jī)碳輸入過程,發(fā)現(xiàn)陸源有機(jī)質(zhì)貢獻(xiàn)呈現(xiàn)隨年代增加而波動降低的變化趨勢,這與近年來亞馬遜河口的沖淡水徑流量和輸沙量變化有關(guān).Yin等[83]分別選取0.65和0作為soil指標(biāo)的陸源和海源端元值,通過soil指標(biāo)的二端元混合模型有效指示了東海沉積物中的有機(jī)質(zhì)來源及貢獻(xiàn)比例.東海沉積有機(jī)質(zhì)中的soil指標(biāo)呈現(xiàn)“離岸降低”的分布特征,陸源有機(jī)質(zhì)貢獻(xiàn)從近岸的63%下降至外海的0.81%.

6 藿類生物標(biāo)志物對好氧甲烷氧化過程的指示

甲烷(CH4)是僅次于CO2的重要溫室氣體.好氧甲烷氧化過程可以將CH4氧化為CO2,有效減少其在環(huán)境中的積累,是一種重要的甲烷匯,在全球甲烷循環(huán)和碳循環(huán)以及氣候變暖中發(fā)揮重要作用[91].參與甲烷氧化的好氧甲烷氧化菌主要包括I型和II型甲烷氧化菌,它們利用CH4為碳源和能源,以O(shè)2為電子受體,將CH4經(jīng)甲醇、甲醛、甲酸最終氧化為CO2[92].甲烷氧化過程中起關(guān)鍵作用的是甲烷單加氧酶(MMO),包括可溶性MMO(sMMO)和顆粒狀MMO(pMMO)[93].與生物膜結(jié)合的pMMO可以催化甲烷的羥基化反應(yīng),它幾乎存在于所有的甲烷氧化菌中,因此通常利用編碼pMMO活性位點多肽的功能基因來調(diào)查環(huán)境中好氧甲烷氧化菌的豐度和活性[93].

由于微生物遺傳基因易受降解作用影響,通常不能用于反演古環(huán)境記錄中的好氧甲烷氧化活動.好氧甲烷氧化菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特異性藿類,在指示好氧甲烷氧化菌群落和反演古甲烷氧化活動方面具有重要作用[94].對好氧甲烷氧化菌特異性的藿類化合物主要是具有3～5個羥基(C-30至C-34)和C-35末端氨基的35-氨基BHPs,以及3-甲基化的(氨基)BHPs(圖2)[15,95].其中,氨基藿五醇幾乎完全由I型好氧甲烷氧化菌合成;氨基藿四醇由I、II型好氧甲烷氧化菌以及少量的硫酸鹽還原菌(SRB)合成;氨基藿三醇來源于所有的好氧甲烷氧化菌及其他好氧細(xì)菌,特異性較低.因此,目前通常將氨基藿四醇、氨基藿五醇同系物(氨基藿五醇、不飽和氨基藿五醇、氨基藿五醇異構(gòu)體)以及它們的3-甲基化BHPs作為環(huán)境中好氧甲烷氧化菌和好氧甲烷氧化過程的生物標(biāo)志物[14-15].

值得注意的是,并不是所有的好氧甲烷氧化菌均具有藿類C-3甲基化基因,且在某些好氧醋酸菌中也被檢測到[95].因此3-甲基(氨基)BHPs作為好氧甲烷氧化菌的標(biāo)志物具有一定的復(fù)雜性.此外,由于微生物優(yōu)先利用環(huán)境中的12C,使生物成因的CH4虧損13C,13C值低至?45‰～?65‰;好氧甲烷氧化菌以CH4為碳源,所合成的藿類化合物通常也虧損13C,13C值約為?35‰～?75‰[96].盡管有研究表明,并非所有好氧甲烷氧化菌產(chǎn)生的藿類都具有13C虧損的同位素特征[41],例如II型甲烷氧化菌可以同時利用CH4和CO2進(jìn)行代謝過程,但沉積環(huán)境中13C值虧損的藿類化合物通常可被認(rèn)為是好氧甲烷氧化活動的標(biāo)志物.Pancost等[97]發(fā)現(xiàn)古第三紀(jì)濕地沉積物中C31和C29藿烷的13C值分別低至?42‰和?76‰,反映該時期強(qiáng)烈的好氧甲烷氧化活動.

一般來說,好氧甲烷氧化菌的生物活性受到溫度、pH值、鹽度、甲烷和有效態(tài)氮等環(huán)境條件的影響,氨基BHPs等藿類可以反映好氧甲烷氧化菌對環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)作用[95,98].例如,培養(yǎng)實驗表明嗜堿好氧甲烷營養(yǎng)菌中BHPs含量隨著鹽度降低和硝酸鹽濃度增加而增加[91].好氧甲烷氧化菌的嗜熱甲基暖菌屬(sp.)中(3-甲基)氨基藿五醇含量隨著溫度升高而增加;當(dāng)環(huán)境中甲烷濃度不足或缺氧時,氨基五醇及其同系物的合成量增加[99].泥炭苔蘚()中好氧甲烷氧化菌產(chǎn)生的里白烯的13C值與溫度和甲烷通量具有良好的相關(guān)性,當(dāng)溫度升高和甲烷濃度增加時,里白烯的13C同位素效應(yīng)更強(qiáng)[100].這表明里白烯的13C值具有指示沉積環(huán)境中好氧甲烷氧化活動的潛能.好氧耐冷甲氧營養(yǎng)菌中不飽和藿醇的含量和比例隨著溫度降低而明顯增加.由此提出了不飽和藿類通過在膜脂上的重新排列以維持低溫下膜穩(wěn)態(tài)的冷適應(yīng)機(jī)制[101].

此外,在海洋最小含氧帶中還存在一種亞硝酸鹽型甲烷氧化,該過程將碳循環(huán)和氮循環(huán)耦合起來,對了解低缺氧環(huán)境中碳和氮元素的生物地球化學(xué)過程具有重要作用[102].亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化菌()是一種獨特的甲烷氧化菌,它以CH4作為碳源和電子供體,NO2-作為電子受體,通過亞硝酸還原酶將NO2-還原產(chǎn)生NO和O2,并利用所產(chǎn)生的O2氧化CH4[103].可以合成BHT、細(xì)菌藿五醇、細(xì)菌藿六醇及它們對應(yīng)的3-甲基BHPs,而并沒有檢測到好氧甲烷氧化菌所獨特的35-氨基BHPs.其中細(xì)菌藿六醇和3-甲基細(xì)菌藿六醇主要來源于,對具有特異性,可作為特征生物標(biāo)志物[104].此外,13C追蹤實驗表明合成的BHPs中的碳來源于HCO3-或者CO2,而不是來源于CH4中碳的同化.因此不同于好氧甲烷氧化菌,所合成的BHPs并不一定表現(xiàn)出13C虧損的同位素特征[104].

7 結(jié)語

微生物膜脂中由基因編碼的藿類合成和修飾酶所調(diào)控的藿類化合物,不僅在微生物理化特征和環(huán)境適應(yīng)方面扮演重要角色,還可作為生物標(biāo)志物有效揭示海洋碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程(如固氮、硝化、厭氧氨氧化和甲烷氧化).2-甲基藿類和不飽和環(huán)醇醚等可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的氧滲透性以保護(hù)固氮酶,可指示環(huán)境中固氮藍(lán)細(xì)菌及固氮過程.作為海洋厭氧氨氧化菌特異性產(chǎn)物的BHT異構(gòu)體—BHT-x,可指示海洋厭氧氨氧化過程和低氧環(huán)境.土壤標(biāo)志物BHPs及其soil指標(biāo)可追蹤陸源土壤有機(jī)質(zhì)向水生環(huán)境的輸入和遷移.35-氨基BHPs和3-甲基(氨基)BHPs可用于指示好氧甲烷氧化過程.

然而,藿類化合物作為碳氮循環(huán)生物標(biāo)志物的研究中仍然存在一些亟待詮釋的科學(xué)問題:1)目前關(guān)于生物藿類BHPs的生物合成過程、受控因素以及不同環(huán)境條件下生理功能與適應(yīng)性的了解仍然不足.隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的不斷發(fā)展,將會進(jìn)一步明確微生物膜脂中藿類化合物的合成及響應(yīng)機(jī)制;2)目前已知的碳氮循環(huán)過程中的生物標(biāo)志物仍然有限.一方面,一些碳氮循環(huán)關(guān)鍵過程缺少特異性的生物標(biāo)志物,特別是反硝化過程、硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)和細(xì)菌參與的氨氧化過程;另一方面,有些類脂生物標(biāo)志物如2-甲基藿類具有來源復(fù)雜性和不確定性,在指示和反演應(yīng)用中需要謹(jǐn)慎考慮.隨著儀器和分析手段的優(yōu)化更新,從復(fù)雜基質(zhì)中鑒定出更多具有特征指示意義的新型生物標(biāo)志物將對深入了解海洋碳氮循環(huán)意義深遠(yuǎn).

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Hopanoids biomarkers and their indications in the marine carbon and nitrogen cycles.

YIN Mei-ling1,2,3,4,DUAN Li-qin1,2,3,4*,SONG Jin-ming1,2,3,4,YUAN Hua-mao1,2,3,4,LI Xue-gang1,2,3,4

(1.Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China；2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China；3.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Sciences,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266237,China；4.Center for Ocean Mega-Science,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China).,2022,42(8)：3890～3902

The microbe-mediated marine biogeochemical cycles of carbon (C) and nitrogen (N) have an important impact on the global climate changes. The hopanoids of pentacyclic triterpenoids,including biological hopanoids (e.g.,bacteriohopanepolyols (BHPs)) and geological hopanoids (e.g.,hopanes),are important lipid biomarkers for indicating and reconstructing C and N cycles in modern and ancient environments. In this paper,we reviewed the biosynthetic pathways and physiological functions of hopanoids,and their roles as indicators in the key processes of the marine C and N cycles (i.e.,nitrogen fixation,nitrification,anammox,methane oxidation and terrestrial organic matter input). The hopanoids in microbial membrane lipids are mainly regulated by enzymes of hopanoids synthesis and modification encoded withgene,which are closely related to microbial physicochemical characteristics and environmental conditions. The oxygen permeability of cell membrane can be regulated by 2-methyl hopanoids,2-methyl cyclitol ether and unsaturated cyclitol ether to protect nitrogenase,being able to indicate the diazotrophic cyanobacteria and N-fixation. Marine anammox bacteriais the only producer known as BHT-x (one of bacteriohopanetetrol isomers) so far,which can indicate marine anammox and hypoxic environment. Soil markers BHPs and terrestrial inputs indicator ofsoilcan track the input and migration of terrestrial organic matter to the ocean. Biomarkers 35-amino BHPs and 3-methyl (amino) BHPs can indicate aerobic methane oxidation. Bacteriohopanehexol and 3-methyl bacteriohopanehexol can indicate nitrite-reducing methanotrophy. With the development of molecular biology,genomics and instrumental analysis technology,hopanoids will play a more important role in indicating marine C and N cycles.

hopanoids；bacteriohopanepolyols (BHPs)；marine nitrogen cycle；aerobic methane oxidation；biomarkers

X145

A

1000-6923(2022)08-3890-13

2022-01-13

國家自然科學(xué)基金資助項目(41976037);山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2020YQ28);青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室“問海計劃”課題(2021WHZZB0903)

*責(zé)任作者,研究員,duanliqin@qdio.ac.cn

尹美玲(1996-),女,中國科學(xué)院海洋研究所博士研究生,主要從事海洋生物地球化學(xué)研究.發(fā)表論文3篇.