葉龍 張莉滟 趙越 顧兵 吳渚 彭永正,4

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510280；2.廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科重癥監(jiān)護(hù)室，廣東廣州 510280；4.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院輸血科，廣東廣州 510280）

近年來，隨著各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的檢出不斷上升，給臨床抗感染治療與醫(yī)院感染防控帶來巨大挑戰(zhàn)，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重后果，2019年美國疾病預(yù)防控制中心最新的抗生素耐藥性報(bào)告中，CRE仍是最緊迫問題［1-2］。兒童和新生兒因免疫力低下、用藥局限等原因，更易導(dǎo)致CRE暴發(fā)流行，但目前現(xiàn)有研究多以成人為主，兒童群體相關(guān)數(shù)據(jù)尚不充分［3］。本研究旨在對(duì)廣東省人民醫(yī)院2018年1月至2021年6月兒童CRE感染情況進(jìn)行分析，明確其耐藥特性與分子流行特征，為對(duì)其有效防控及科學(xué)預(yù)判流行趨勢(shì)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

參照中國兒童細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)組標(biāo)準(zhǔn)［4］，本文將≤14歲患兒納入研究范圍?；仡櫺苑治鰪V東省人民醫(yī)院2018年1月至2021年6月住院患兒的相關(guān)臨床資料及感染情況，共獲得非重復(fù)菌株腸桿菌目細(xì)菌1 098株。按照全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［5］，對(duì)菌株進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

哥倫比亞血瓊脂與M-H瓊脂培養(yǎng)基購自廣州迪景公司；藥敏紙片購自英國OXOID公司；PCR引物由TaKaRa公司合成，1×T3 Super PCR Mix及DNA Marker（DL-2000）購自擎科生物科技有限公司。VITEK MS微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)與VITEK 2 Compact微生物鑒定儀及相關(guān)試劑購自法國梅里埃公司；PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bi o-Rad公司。

1.3 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC 8739與ATCC 25922、陰溝腸桿菌ATCC 700323由廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.4 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)

用配套儀器對(duì)部分細(xì)菌進(jìn)行鑒定及藥敏復(fù)核試驗(yàn)，采用M-H瓊脂培養(yǎng)基行紙片擴(kuò)散法驗(yàn)證厄他培南、亞胺培南、美羅培南的藥敏情況，其中任何1種藥物耐藥，即可確定為CRE菌株。紙片擴(kuò)散法操作及相關(guān)藥敏結(jié)果的判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)M100-S32標(biāo)準(zhǔn)［6］，頭孢哌酮/舒巴坦藥敏結(jié)果的判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)M100-S32腸桿菌目細(xì)菌對(duì)頭孢哌酮的折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)［6］。

1.5 CRE初篩與確證試驗(yàn)

對(duì)CRE菌株采用改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）檢測(cè)碳青霉烯酶，并聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試 驗(yàn) （EDTA-modified carbapenem inactivation method，eCIM）檢測(cè)金屬酶，進(jìn)行初篩試驗(yàn)。隨后提取菌株基因組DNA，采用PCR法檢測(cè)菌株所攜帶碳青霉烯酶耐藥基因情況（引物設(shè)計(jì)參照相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，引物序列見表1），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)顯像并觀察結(jié)果。再將PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)基本局部比對(duì)搜索工具BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析，確定所測(cè)菌株攜帶的的耐藥基因。

表1 碳青霉烯酶主要檢測(cè)的耐藥基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用WHONET 5.6及SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般資料

1 098株腸桿菌目細(xì)菌中共檢出CRE 66株，檢出率為6.01%。66株CRE來自66例患兒，其中男37例（56%），女29例（44%）。年齡2 d至14歲，其中<1月齡16例（24%），1月齡~28例（42%），12月齡~11例（17%），>36月齡11例（17%）。住院中位時(shí)間32 d，CRE分離中位時(shí)間為入院后第12天。伴有基礎(chǔ)疾病主要為呼吸道疾?。?7例，86%）、心血管疾?。?6例，70%）、消化道疾病（12例，18%）及腎臟疾?。?0例，15%）等。多數(shù)患兒伴侵襲性操作，如氣管插管（56例，85%）、手術(shù)（48例，73%）、靜脈插管（41例，62%）、尿道插管（37例，56%）及穿刺引流（31例，47%）等。預(yù)后情況：治愈45例（68%），好轉(zhuǎn)回所在地繼續(xù)治療14例（21%），死亡7例（11%），其中兒科重癥監(jiān)護(hù)室5例，新生兒科和兒童血液科各1例。死亡患兒患有急性胃腸炎、肺膿腫伴有肺炎、白血病、梗阻性腦積水、先天性心臟畸形等不同程度基礎(chǔ)疾病，死因包括感染性休克2例、先天性心臟病2例、重癥肺炎1例、血液病1例、腦腫瘤1例。

2.2 標(biāo)本與科室分布

66株CRE主要在呼吸道、中段尿、血液標(biāo)本中被檢出；被檢出CRE的患兒主要來自新生兒科、兒科重癥監(jiān)護(hù)室、兒童血液科、心外科重癥監(jiān)護(hù)室等科室。見圖1。

圖1 CRE的標(biāo)本類型和科室分布 左圖為標(biāo)本類型分布（n=66）；右圖為科室分布（n=66）。

2.3 致病菌分布

66株CRE中，肺炎克雷伯菌45株（68%）、大腸埃希菌12株（18%）、陰溝腸桿菌6株（9%）、黏質(zhì)沙雷菌2株（3%）、產(chǎn)氣腸桿菌1株（2%）。其中，新型冠狀病毒肺炎（簡(jiǎn)稱新冠）疫情發(fā)生前（2018~2019年）檢出CRE 47株，檢出率為6.5%（47/723）；新冠疫情發(fā)生后（2020~2021年）檢出CRE 19株，檢出率為5.1%（19/375）。雖然新冠疫情后住院患兒CRE的檢出率低于新冠疫情前，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.899，P=0.343）。

2.4 主要CRE菌株藥敏情況

66株CRE菌株對(duì)碳青霉烯類（亞胺培南、厄他培南）、青霉素復(fù)方制劑（氨芐西林/舒巴坦）、部分頭孢類（頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦）抗菌藥物高度耐藥，對(duì)常見抗菌藥物（氨曲南、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素）耐藥性普遍偏高，僅對(duì)阿米卡星（14%）、左旋氧氟沙星（23%）、妥布霉素（33%）等耐藥率相對(duì)較低，見表2。

表2 CRE感染患兒主要致病菌的耐藥率 ［株（%）］

2.5 主要CRE的碳青霉烯酶耐藥基因分析

PCR結(jié)果顯示，45株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM（20株，44%）、blaIMP（10株，22%）及blaKPC（5株，11%）為主；12株大腸埃希菌的碳青霉烯酶基因型以blaNDM為主（10株，83%）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，blaNDM-124株，blaNDM-56株，blaIMP-45株，blaKPC-23株，仍有尚未明確基因型，有待進(jìn)一步研究。

3 討論

CRE感染給公共衛(wèi)生防控帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，據(jù)中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示［9］：肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南與美羅培南的耐藥率從2005年的3.0%、2.9%持續(xù)上升至2018年的25.0%、26.3%，雖然2019年和2020年呈下降趨勢(shì)，但2021年又有回升。兒童尤其新生兒因免疫力低下、用藥局限等原因，CRE的檢出率高于成人，且易引起流行。多項(xiàng)研究表明，臨床分離的肺炎克雷伯菌在兒科病房有顯著增高趨勢(shì)，且兒童醫(yī)院CRE的分離率要高于綜合性醫(yī)院［10-12］。

本研究中CRE菌株的檢出率為6.01%，與報(bào)道［13］一致。據(jù)中國兒童細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)組數(shù)據(jù)［13-14］，2020年兒童CRE總體檢出率為4.9%，低于2019年的8.2%，均低于同時(shí)期以成人為主的相關(guān)數(shù)據(jù)［15-16］。本研究試著分析新冠疫情發(fā)生前后腸桿菌目細(xì)菌檢出情況，結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明疫情防控可能對(duì)我院兒童CRE檢出影響不大，需要長(zhǎng)期關(guān)注。

66例CRE患兒集中在新生兒科和兒科重癥監(jiān)護(hù)室，<12月齡占比最多，與研究［17-18］一致。一方面這可能與患兒免疫系統(tǒng)不成熟、住院時(shí)間久和頻繁進(jìn)行侵入性操作有關(guān)，且患兒相較于成人，需要醫(yī)生護(hù)士的協(xié)助較多，相互間接觸概率增加，進(jìn)而加大CRE院內(nèi)傳播的機(jī)會(huì)。另一方面我院碳青霉素類抗菌藥物主要用于危重癥監(jiān)護(hù)室，以及免疫力低下患者，如燒傷科、血液科等。有研究［19］表明，重癥監(jiān)護(hù)室的病原菌容易呈現(xiàn)多重耐藥的特點(diǎn)，同時(shí)重癥監(jiān)護(hù)室環(huán)境中更容易出現(xiàn)耐藥菌的定植，增大CRE感染風(fēng)險(xiǎn)。再者，兒童用藥原則與成人不同，其抗感染可用的藥物選擇有限，在當(dāng)前新生兒或兒科重癥的治療中超說明書用藥現(xiàn)象常見，這也是CRE菌株檢出率高的原因之一。

CRE最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶［20］，利用mCIM聯(lián)合eCIM初篩試驗(yàn)可將其初步分為金屬酶和絲氨酸酶。有研究報(bào)道，金屬酶對(duì)碳青霉烯類藥物具有較強(qiáng)水解能力，可導(dǎo)致高水平耐藥發(fā)生，會(huì)給臨床治療帶來極大困難［21-22］。本研究碳青霉烯酶的耐藥基因以NDM型、IMP型、KPC型為主，與報(bào)道［16］相一致；45株肺炎克雷伯菌中，以產(chǎn)NDM型和IMP型金屬酶為主，與報(bào)道［23-24］相符，這與成人中以產(chǎn)KPC型絲氨酸酶為主不同；另12株大腸埃希菌也以NDM型金屬酶為主。本研究66株CRE菌株對(duì)常見抗菌藥物耐藥性均普遍偏高，僅對(duì)部分氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥率相對(duì)較低。但由于氨基糖苷類和喹諾酮類藥物的不良反應(yīng)，對(duì)兒童革蘭陰性多重耐藥菌感染的治療主要依賴于碳青霉烯類藥物，加之兒童免疫力低下，一旦發(fā)生CRE感染，臨床治療較成人更加嚴(yán)峻，常陷入無藥可用的境地，亟待新型抗菌藥物的研發(fā)［25］。近些年，聯(lián)合應(yīng)用多黏菌素、替加環(huán)素與磷霉素等療法；新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（齊德巴坦、納庫巴坦等）及新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑（頭孢他啶/阿維巴坦、亞胺培南/瑞巴坦、美羅培南/法硼巴坦等）正被積極開發(fā)，給CRE抗感染治療帶來一線曙光［26］。新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑的抗CRE感染作用也與碳青霉烯酶的基因型高度相關(guān)，有研究報(bào)道頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)KPC或OXA-48型絲氨酸酶菌株具有療效，但其對(duì)產(chǎn)NDM金屬酶菌株的治療無明顯效果［27］。因此，兒童CRE患者在應(yīng)用此類藥物前，務(wù)必要加強(qiáng)臨床與檢驗(yàn)的溝通，及時(shí)明確碳青霉烯酶基因型，同時(shí)積極探索快速檢測(cè)碳青霉烯酶基因型的方法［28］?，F(xiàn)今關(guān)于這些新型抗菌藥物的臨床經(jīng)驗(yàn)及評(píng)估它們用于兒童人群的臨床報(bào)道都很有限，兒童CRE感染治療仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究中有部分CRE菌株的碳青霉烯酶基因型未明確，有待深入探討，以便全面了解兒童CRE的耐藥機(jī)制與分子流行情況，為患兒臨床治療和感染防控提供更多線索。

綜上所述，兒童CRE感染發(fā)生率高，且集中于1~12月齡嬰兒。CRE對(duì)抗菌藥物的耐藥性普遍偏高，兒童感染CRE菌株的碳青霉烯酶以金屬酶為主。積極開展CRE主動(dòng)篩查，加強(qiáng)兒童病區(qū)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)，提升醫(yī)護(hù)人員防控意識(shí)，優(yōu)化抗菌藥物使用，從而遏制兒童CRE感染的暴發(fā)與流行。