劉麗麗，朱芳來(lái)

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246000)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)相關(guān)資料顯示，2018年全球新發(fā)胃癌1 000 000例，死亡783 000例，居全球惡性腫瘤發(fā)病率第五位，居腫瘤死亡率第三位[1]。2015年我國(guó)癌癥調(diào)查資料顯示全年新發(fā)胃癌數(shù)400 000例，居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第二位[2]。目前胃癌的診斷主要依靠胃鏡及影像學(xué)檢查，但均存在檢出率低的缺點(diǎn)，且多數(shù)檢出者已為進(jìn)展期或晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)期。近年來(lái)胃癌的發(fā)病率及死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)[3]，對(duì)我國(guó)及全球的衛(wèi)生健康事業(yè)提出了巨大的挑戰(zhàn)。因此，發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物對(duì)于胃癌的早期診斷及干預(yù)意義重大。本文基于生物信息學(xué)分析方法，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，篩選與胃癌生存預(yù)后的相關(guān)基因，為胃癌的早期診斷提供新的檢測(cè)標(biāo)志物及新的治療方向。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1 材料與方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)的獲?。和ㄟ^公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI Gene Expression Omnibus(NCBI GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載與胃癌相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；②物種為人類；③包含正常對(duì)照組。得到四個(gè)與胃癌相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集：GSE19826(GPL570平臺(tái))，GSE29998(GPL6947平臺(tái))，GSE54129(GPL570平臺(tái))，GSE79973(GPL570平臺(tái))。所有芯片數(shù)據(jù)均由貢獻(xiàn)者上傳至GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，GEO提供原始芯片數(shù)據(jù)和經(jīng)過預(yù)處理的矩陣文件。四個(gè)胃癌芯片數(shù)據(jù)集共包含腫瘤組織樣本183例，正常胃黏膜組織標(biāo)本95例。

1.2數(shù)據(jù)處理及對(duì)差異表達(dá)基因的篩選:考慮芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于不同的處理平臺(tái)，數(shù)據(jù)處理方式存在不同，因此，在對(duì)不同芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理之前，統(tǒng)一采取相同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用RMA(Robust Multiarray Average)算法對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)疾病情況將樣本分為腫瘤組(tumor)及正常對(duì)照組(normal)，利用R軟件(v.3.5.0)中的Limma包對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，設(shè)定P value值及對(duì)數(shù)化表達(dá)倍數(shù)變化(log2 fold change，log2FC)作為篩選差異基因的閾值，整合各芯片數(shù)據(jù)集后得出各芯片數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)的基因。

1.3不同芯片數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的整合:利用RRA算法對(duì)四個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)集中具有差異表達(dá)的基因進(jìn)行整合分析，獲得不同芯片數(shù)據(jù)集中共有的差異表達(dá)基因。

1.4差異表達(dá)基因的GO分析及KEGG通路富集分析:DAVID(https://david.ncifcrf.gov)是基因功能分析最常用的在線分析網(wǎng)站，其可以對(duì)大規(guī)模的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行功能分析。將四個(gè)芯片數(shù)據(jù)集整合后獲得的差異表達(dá)基因?qū)隓AVID 6.8在線分析網(wǎng)站，以P<0.05作為篩選條件。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，最常用的功能注釋包括GO(Gene Ontology)分析及KEGG通路富集分析。通過在線網(wǎng)站分析這些差異表達(dá)基因主要的生物功能以及可能涉及的信號(hào)通路。

1.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:String(https://string-db.org)是研究蛋白與蛋白相互作用的在線生物信息學(xué)網(wǎng)站。本研究將表達(dá)差異的基因?qū)隨tring 11.0在線分析網(wǎng)站，設(shè)置最低互作分值(minimum required interaction score)的可信度(high confidence:0.15)，獲得蛋白相互作用的數(shù)據(jù)，然后通過Cytoscape軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化和進(jìn)一步分析。

1.6生存分析：Kaplam-Meier Plotter(http://kmplot.com)是常用的在線生存分析網(wǎng)站。本研究將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出的基因?qū)隟aplam-Meier Plotter在線分析網(wǎng)站，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1不同胃癌基因芯片中差異表達(dá)的基因：利用RMA算法對(duì)四個(gè)胃癌基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，通過R軟件Limma包對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得差異表達(dá)的基因。見圖1。其中數(shù)據(jù)集GSE19826獲得上調(diào)基因376個(gè)，下調(diào)基因478個(gè)，見圖2A；數(shù)據(jù)集GSE29998上調(diào)基因879個(gè)，下調(diào)基因815個(gè)，見圖2B；數(shù)據(jù)集GSE54129獲得上調(diào)基因1 051個(gè)，下調(diào)基因1 080個(gè)，見圖2C；數(shù)據(jù)集GSE79973獲得上調(diào)基因460個(gè)，下調(diào)基因477個(gè)，見圖2D。并利用火山圖分別展示各數(shù)據(jù)集差異表達(dá)的基因。見圖2。

A GSE19826的標(biāo)注化處理；B GSE29998的標(biāo)準(zhǔn)化處理；C GSE54129的標(biāo)準(zhǔn)化處理；D GSE79973的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

A GSE19826；B GSE29998；C GSE54129；D GSE79973

2.2四個(gè)胃癌數(shù)據(jù)集差異基因的整合：本研究用RRA算法對(duì)四個(gè)芯片數(shù)據(jù)集的差異基因進(jìn)行整合后獲得在四個(gè)數(shù)據(jù)集中共有的差異表達(dá)基因。最終確定了49個(gè)差異基因，其中有21個(gè)上調(diào)基因和27個(gè)下調(diào)基因。最后用R軟件heatmap包繪制了前20個(gè)上調(diào)和前20個(gè) 下調(diào)基因的熱。見圖3。

圖3 四個(gè)胃癌基因數(shù)據(jù)集的整合后獲得最具差異表達(dá)的20個(gè)上調(diào)基因以及20個(gè)下調(diào)基因

2.3差異基因的GO分析及KEGG通路富集分析：利用RRA算法獲得候選差異表達(dá)基因后，利用在線功能分析網(wǎng)站DAVID分析差異基因的功能及富集的信號(hào)通路。本研究限定P value<0.05為功能分析的限定條件。GO分析主要包括生物過程、細(xì)胞外組成及分子功能三部分。從分析結(jié)果可以得知，差異表達(dá)基因主要參與對(duì)膠原分解代謝、對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞黏附等過程；而細(xì)胞組成分析顯示這些基因大多參與細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等的組成；在分子功能方面，則主要與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、蛋白酶結(jié)合、血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合、視黃醇脫氫酶活性、內(nèi)向整流鉀通道活性、鈣依賴性半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等相關(guān)。見表1及圖4。利用DAVID富集得到四條與差異基因相關(guān)的通路，包括蛋白質(zhì)的消化與吸收通路(hsa04974:Protein digestion and absorption)、細(xì)胞外基質(zhì)通路(hsa04512:ECM-receptor interaction)、局部黏附通路(hsa04510:Focal adhesion)以及細(xì)胞色素P450代謝通路(hsa00980:Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)。利用Cytoscape對(duì)其進(jìn)行可視化處理后發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因富集的通路主要為細(xì)胞色素P450及蛋白質(zhì)的消化與吸收通路，上調(diào)基因則與細(xì)胞的局部黏附、蛋白質(zhì)消化與吸收、細(xì)胞外基質(zhì)通路有關(guān)。見圖5。

表1 差異表達(dá)基因的GO分析

紅色代表信號(hào)通路；橙色代表分子功能；藍(lán)色代表細(xì)胞內(nèi)組成；綠色代表生物過程

紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色代表信號(hào)通路

2.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的分析：為了進(jìn)一步更好地說明這些差異表達(dá)基因與胃癌之間的關(guān)系，本研究利用在線分析網(wǎng)站String構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定可信度為0.14后得到各差異表達(dá)基因之間的相互作用。見圖6。利用Cytoscape進(jìn)行可視化，篩選出相互作用節(jié)點(diǎn)度大于10的候選基因15個(gè)，分別為：FNDC，CTHRC，COL1A1，COL1A2，COL6A3，COL10A1，CDH3,INHBA，SULF1，F(xiàn)AP，SFRP4，BGN，THBS2，THY1，TIMP1。見圖7。對(duì)這些候選基因功能分析后發(fā)現(xiàn)多數(shù)候選基因參與了組織器官的分化、發(fā)育過程，提示可能為胃癌發(fā)生的關(guān)鍵基因。

圖6 差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因

2.5差異基因生存分析：對(duì)篩選出的15個(gè)候選基因利用在線分析網(wǎng)站Kaplam-Meier Plotter進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)，除FAP和CDH3外，其余13個(gè)候選基因均與胃癌的預(yù)后相關(guān)，猜測(cè)為胃癌發(fā)病的關(guān)鍵基因。見圖8。

圖8 差異表達(dá)基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及諸多因素的復(fù)雜過程，其中包括各種原癌基因與抑癌基因之間的失衡以及與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路的激活[4]，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前對(duì)于胃癌的具體發(fā)病機(jī)制也仍在不斷的研究中。目前對(duì)于胃癌的臨床診斷主要為內(nèi)鏡及影像學(xué)等檢查，但檢出率均較低，且多數(shù)被檢出者均已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后差；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)CA72-4雖對(duì)胃癌的發(fā)病有一定提示作用，但敏感性及靈敏度均較低。近三十年來(lái)，胃癌的發(fā)病呈總體上升趨勢(shì)[3]，對(duì)我國(guó)的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)提出了巨大挑戰(zhàn)，因此，對(duì)胃癌做出早期診斷及早期干預(yù)對(duì)于個(gè)人、家庭、社會(huì)都意義重大，但我國(guó)目前尚缺乏系統(tǒng)的早期診療規(guī)范。因此，亟需發(fā)現(xiàn)有助于胃癌早期診斷的新的臨床標(biāo)志物。

本研究提示差異基因主要參與膠原分解代謝、組織器官的分化發(fā)育等過程，KEGG通路富集則提示差異表達(dá)基因能夠參與蛋白質(zhì)的消化與吸收、細(xì)胞局部黏附、細(xì)胞色素P450代謝、細(xì)胞外基質(zhì)組織信號(hào)通路；為了進(jìn)一步篩選與胃癌發(fā)生的相關(guān)基因，進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，多數(shù)候選基因均與癌癥的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系，如Wang等通過相關(guān)研究認(rèn)為INHBA在胃癌患者中高水平表達(dá)時(shí)提示預(yù)后差[5]；一篇關(guān)于TIMP1與胃癌之間關(guān)系的綜述表明胃癌患者組織或外周血中的TIMP1水平水平升高與胃癌患者的預(yù)后不良有關(guān)[6]；Zhong等同樣發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)高水平THY1與胃癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[7]；COL1A1、COL1A2、COL6A3、COL10A1同屬膠原蛋白家族，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)COL1A1與COL1A2在胃癌組織中高表達(dá)，并提示預(yù)后較差[8]；而抑制COL6A3表達(dá)時(shí)可以通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，從而改善胃癌患者的預(yù)后[9]；而相關(guān)研究也證實(shí)COL10A1在胃癌的發(fā)展過程中扮演著重要角色，可以促進(jìn)胃癌的侵襲及代謝過程[10]，提示篩選出的候選基因可能為胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)四個(gè)胃癌芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析及整合，獲得差異表達(dá)基因，利用GO分析及KEGG通路富集分析對(duì)差異基因進(jìn)行功能分析，揭示差異表達(dá)基因的生物功能及與之相關(guān)的信號(hào)通路，并通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)從分子水平篩選與胃癌相關(guān)的差異表達(dá)基因，最后利用在線分析網(wǎng)站對(duì)候選基因進(jìn)行與胃癌生存預(yù)后的分析，獲得與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步的細(xì)胞水平的研究提供理論支持，并對(duì)胃癌發(fā)生機(jī)制的研究提供新的方向，并為胃癌的早期診斷提供新的檢測(cè)標(biāo)記物。