黃奕平，俞 敏，張麗君

(深圳市龍崗中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518000)

腦血管病具有較高的發(fā)病率、致殘率以及致死率，是導(dǎo)致人類死亡的第二大原因，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年因腦血管疾病死亡的人數(shù)已突破650萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2030年死亡率可能突破780萬(wàn)[1-2]。受人口老齡化的影響，腦血管病的發(fā)病人數(shù)與日俱增，嚴(yán)重威脅人類的生命安全，已受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的共同關(guān)注。且隨著近年來(lái)相關(guān)研究的不斷深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可能在腦血管病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3]。MMPs主要是指以組含有可降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，目前主要是按照結(jié)構(gòu)以及底物特異性的差異將其分作明膠酶(如MMP-2與MMP-9)，基質(zhì)溶解素(如MMP-3與MMP-7)，間質(zhì)膠原酶(如MMP-1與MM-2)等[4]。且有研究報(bào)道顯示：MMPs會(huì)對(duì)血管基質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，繼而干擾腦血管的完整性，同時(shí)對(duì)血腦屏障造成損傷，可能加劇腦損傷的發(fā)生[5]。鑒于此，本文通過(guò)研究MMP-1、MMP-3、MMP-9主要基因位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦血管病的相關(guān)性，旨在為腦血管病的治療尋求新的靶點(diǎn)，并為腦血管病患者的預(yù)后及生活質(zhì)量改善提供參考依據(jù)，進(jìn)一步減少社會(huì)對(duì)腦血管病治療所支出的巨大醫(yī)療成本。

1 對(duì)象與方法

1.1一般資料：選取2016年7月～2020年10月我院收治的短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)患者100例以及急性腦卒中患者100例作為研究對(duì)象，分別作為TIA組以及卒中組。另選取同期體檢的健康志愿者100例作為對(duì)照組。TIA組男63例，女37例；年齡34～78歲，平均(58.93±3.55)歲；體重指數(shù)(BMI)19～28 kg/m2，平均(22.52±2.10)kg/m2；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?1例，糖尿病56例；吸煙58例，飲酒40例。入選標(biāo)準(zhǔn)[6]：①均經(jīng)相關(guān)檢查確診為TIA；②年齡均已超過(guò)40歲；③并無(wú)其他腦血管病；④無(wú)惡性腫瘤或(和)自身免疫性疾病。TIA判定標(biāo)準(zhǔn)：局灶性腦功能損害癥狀和體征在24 h內(nèi)(多數(shù)1 h內(nèi))完全恢復(fù)；急性發(fā)作性病程(多在2～3 min)；符合TIA發(fā)作時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征。卒中組男65例，女35例；年齡33～79歲，平均(58.84±3.56)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.59±2.15)kg/m2；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?2例，糖尿病53例；吸煙55例，飲酒41例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①均為急性發(fā)作；②病程不足2周；③頭顱CT、MRI確診；④以往未發(fā)生過(guò)腦血管??；⑤年齡均已超過(guò)40歲；⑥無(wú)惡性腫瘤或(和)自身免疫性疾病。對(duì)照組男67例，女33例；年齡32～79歲，平均(58.89±3.59)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.61±2.13)kg/m2；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?9例，糖尿病51例；吸煙54例，飲酒42例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡均已超過(guò)40歲；②無(wú)腦血管病或惡性腫瘤或其他自身免疫性疾病等。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法：①血清MMP-1、MMP-3、MMP-9及Vaspin、Chemerin水平水平檢測(cè)：血液標(biāo)本采集時(shí)機(jī)選擇為清晨空腹?fàn)顟B(tài)，采集靜脈血量為3 ml，實(shí)施時(shí)長(zhǎng)為10 min的3 000r/min離心處理，獲取血清保存?zhèn)溆?。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法完成上述各項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)水平的檢測(cè)，具體操作務(wù)必遵循試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。試劑盒均由深圳晶美生物科技有限公司提供。②基因位點(diǎn)測(cè)定：MMP-1基因型檢測(cè)：基因位點(diǎn)為C-161T，基因型包括C/C(野生純合子)、C/T(突變雜合子)、T/T(突變純合子)。第一步即以酚-氯仿抽提法自外周血有核細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA，隨后完成PCR擴(kuò)增PPAR-γ2基因Pro12Ala多態(tài)性片段操作。上、下游引物序列分別為5'-CAAGCCCAG TCCTTTCTGTG-3'、5'-AGTGAAGGAATCGC TTTCCG-3'。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃ 7 min。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上完成(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad)。然后以PCR-RFLP法完成多態(tài)性的檢測(cè)，純化處理PCR產(chǎn)物后經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅡ(購(gòu)自美國(guó)Promegar公司)酶切，酶切位點(diǎn)為C/C GG。37℃水浴酶解4 h，經(jīng)8%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，EB染色后讀取基因型;MMP-3基因型檢測(cè)：基因位點(diǎn)為rs3025058，基因型包括5A純合子、6A純合子以及5A/6A雜合子?；驒z測(cè)方式與MMP-1基因相同，上、下游引物序列分別為5'-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3'、5'-TTCCCCCATEAAAGGAATGGAGAACC-3';MMP-9基因型檢測(cè)：基因位點(diǎn)為SNP rs 3918242，基因型包括C/C純合子、T/T純合子以及T/C雜合子?；驒z測(cè)方式與MMP-1基因相同，上、下游引物分別為5'-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3'、5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATA-3'。③血清Vaspin及Chemerin水平檢測(cè)。

1.3觀察指標(biāo)：比較三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平和基因型情況；分析血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié)果

2.1三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平評(píng)價(jià)：TIA組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水分別為(122.34±8.15)μg/L、(93.21±8.03)μg/L、(132.74±8.37)μg/L，明顯高于卒中組的(86.83±6.29)μg/L、(57.22±5.71)μg/L、(110.42±5.23)μg/L，且卒中組上述各項(xiàng)指標(biāo)水平均高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平評(píng)價(jià)

2.2血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的ROC曲線分析：血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平聯(lián)合診斷TIA的曲線下面積、敏感性及特異性均高于上述三項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。見(jiàn)表2。

表2 血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的ROC曲線分析

2.3三組MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情況評(píng)價(jià)：TIA與卒中組MMP-1/C-161T基因型CC人數(shù)占比相較于對(duì)照組顯著更高，而CT、TT人數(shù)占比相較于對(duì)照組明顯更低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情況評(píng)價(jià)[n(%)，n=100]

2.4三組血清Vaspin及Chemerin水平對(duì)比：TIA組、卒中組血清Vaspin水平均低于對(duì)照組，且TIA組血清Vaspin水平低于卒中組；TIA組、卒中組血清Chemerin水平均高于對(duì)照組，且TIA組血清Chemerin水平高于卒中組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 三組血清Vaspin及Chemerin水平對(duì)比

3 討論

TIA和腦卒中是臨床上較為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高以及致死率高的特點(diǎn)，根本病因?yàn)槟X部血氧供應(yīng)缺乏[8-9]。相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，該類患者存在一定程度的腦組織局部動(dòng)脈血流減少，因此腦組織往往發(fā)生缺血、缺氧，繼而導(dǎo)致神經(jīng)功能出現(xiàn)損傷，預(yù)后不良[10-12]。相關(guān)研究報(bào)道顯示，早期預(yù)測(cè)TIA及腦卒中是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，亦是目前臨床醫(yī)務(wù)人員共同關(guān)注的熱點(diǎn)[13-15]。迄今為止，臨床上針對(duì)腦血管病的影像學(xué)檢查手段包括超聲、磁共振成像以及CT等，患者一旦發(fā)生明確的影像學(xué)變化，往往提示腦血管狀況較差，預(yù)后不良。由此可見(jiàn)，尋求一種更為積極、有效的缺血性腦血管病早期診斷方式顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點(diǎn)。

MMP-1相較于MMPs家族其他成員而言，具有較高的表達(dá)，主要作用是對(duì)人體內(nèi)豐富的Ⅰ型、Ⅲ型膠原組織起到明顯的降解作用，可能參與了腦血管病的發(fā)病過(guò)程，并在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。MMP-3是MMPs家族中另一重要酶，主要是通過(guò)影響其他MMPs活性以及功能的途徑，進(jìn)一步介導(dǎo)腦血管病的發(fā)生、發(fā)展。臨床一項(xiàng)關(guān)于MMP-3單核苷酸多態(tài)性的研究證實(shí)[17]，SNP和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度以及心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)性密切相關(guān)。且體內(nèi)外的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)[18]：MMP-3在血管組織內(nèi)高表達(dá)于5A純合子，低表達(dá)于6A純合子，且5A純合子人群相較于6A純合子人群而言，動(dòng)脈粥樣硬化程度顯著增加。MMP-9則是目前國(guó)內(nèi)外研究最多的一種MMPs，已被證實(shí)其活性和單核苷酸多態(tài)性不但和腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)，亦和全身動(dòng)脈硬化有一定聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，TIA患者血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平存在明顯高表達(dá)，且聯(lián)合檢測(cè)上述三項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)水平診斷TIA的效能較高。究其原因可能是MMPs可對(duì)血管基質(zhì)造成一定程度的破壞，同時(shí)影響腦血管的完整性，損傷血腦屏障，繼而引起腦損傷的加劇。張麗君等人已得到與本研究相似結(jié)果[19]：TIA患者以及腦卒中患者的血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平均明顯高于健康人群，且TIA患者的上述各項(xiàng)指標(biāo)水平均高于腦卒中患者。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-1基因多態(tài)性可能和缺血性腦血管病密切相關(guān)，但MMP-3及MMP-9基因多態(tài)性和缺血性腦血管病無(wú)關(guān)?？紤]原因可能是MMP-1/C-161T基因會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)早進(jìn)入不穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)一步促進(jìn)了缺血性腦血管病的發(fā)生、發(fā)展。這在俞敏等人的研究報(bào)道中得以佐證[20]：MMP-1基因多態(tài)性可能和缺血性腦血管疾病有關(guān)。本文結(jié)果還顯示，TIA組、卒中組血清Vaspin水平均低于對(duì)照組，且TIA組血清Vaspin水平低于卒中組；TIA組、卒中組血清Chemerin水平均高于對(duì)照組，且TIA組血清Chemerin水平高于卒中組。Vaspin可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號(hào)通路，繼而減少有利脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制P34/hap27信號(hào)通路，減少活性氧產(chǎn)生，從而抑制血小板原生長(zhǎng)因子所引起的平滑肌細(xì)胞遷移，進(jìn)一步抑制疾病的發(fā)生、發(fā)展。Chemerin屬于機(jī)體內(nèi)的關(guān)鍵性代謝性影響因子，其異常表達(dá)可通過(guò)影響脂質(zhì)代謝紊亂，繼而增加低密度脂蛋白對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步導(dǎo)致粥樣硬化或動(dòng)脈關(guān)閉狹窄發(fā)生。

綜上所述，血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平聯(lián)合檢測(cè)可用作TIA的臨床診斷，且MMP-1基因多態(tài)性可能和缺血性腦血管病密切相關(guān)，而MMP-3及MMP-9基因多態(tài)性和缺血性腦血管病無(wú)關(guān)。此外，血清Vaspin、Chemerin表達(dá)的異?？赡茉谌毖阅X血管病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。