楊劍豪 徐蓓 邱穎婕 章舜瑋 周燕 何智純

微生物污染造成的感染性輸血反應(yīng)一直是影響輸血安全的重要因素[1]。隨著病毒檢測(cè)技術(shù)的日益進(jìn)步，病毒經(jīng)血傳播率已明顯下降，但由輸血傳播的細(xì)菌感染卻仍長(zhǎng)期存在（發(fā)生率約為病毒的10～1000倍）[2]，常見血液制品中，血小板的儲(chǔ)存條件更適于細(xì)菌繁殖，因而污染問題突出[3]；與血小板相比，紅細(xì)胞制品由于儲(chǔ)存溫度低，其細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)明顯低于前者（發(fā)生率約1/2000 000），但紅細(xì)胞臨床輸注量遠(yuǎn)高于其他制品，因此其對(duì)血液安全的影響仍值得關(guān)注[4]。

盡管采取了很多措施以降低細(xì)菌殘留量，如增加初血分離環(huán)節(jié)以及細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)，但是感染性輸血反應(yīng)仍會(huì)繼續(xù)發(fā)生，獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒不徹底是細(xì)菌污染的主要原因[5]。毛囊和皮脂腺是皮膚微生物主要寄居地，皮膚穿刺時(shí)完整性被破壞，殘留的細(xì)菌將隨靜脈穿刺部位帶進(jìn)血液，污染血液制品皮膚微生物可分為常駐菌群與暫住菌群，研究發(fā)現(xiàn)皮膚常駐菌群所定殖的宿主存在個(gè)體差異，例如性別、年齡、工作生活環(huán)境等[6]。

隨著基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)在采供血機(jī)構(gòu)的應(yīng)用[7]，可縮短微生物的鑒定時(shí)間，提高細(xì)菌的陽性檢出率，確保血液制品的輸注安全。本研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)200名獻(xiàn)血者手臂皮膚樣本進(jìn)行細(xì)菌鑒定，評(píng)估現(xiàn)用消毒方式對(duì)不同性別、年齡、工作性質(zhì)的獻(xiàn)血者手臂消毒的效果，并分析各組之間是否存在顯著差異，現(xiàn)匯報(bào)如下。

資料與方法

1 研究對(duì)象

1.1 隨機(jī)選擇2020年1月～6月在上海市血液中心參加全血捐獻(xiàn)的200名獻(xiàn)血者作為研究對(duì)象, 其中男性，女性各100名。

1.2 對(duì)獻(xiàn)血者開展問卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括：年齡、職業(yè)、工作環(huán)境的溫度和濕度等。

1.3 根據(jù)獻(xiàn)血者性別、年齡和職業(yè)環(huán)境分組，將調(diào)查對(duì)象分組為男性組，女性組；≤30歲組，＞30歲組；室內(nèi)工作者組和室外工作者組（將日平均戶外工作時(shí)長(zhǎng)＞6 h作為室外工作者，其余為室內(nèi)工作者）。

1.4 對(duì)獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒前與消毒后的表面菌落數(shù)和菌種進(jìn)行鑒定分析。

2 主要試劑與儀器

在進(jìn)行腳本開發(fā)時(shí)，必須注意到作為一個(gè)組件，腳本不能孤立于游戲?qū)ο蠖?dú)立運(yùn)行，即必須添加到游戲?qū)ο笊喜拍苌АＣ恳粋€(gè)腳本文件必然包含一個(gè)與腳本文件名相同且繼承自MonoBehaviour的Public類，MonoBehaviour類中常用的方法構(gòu)成了Unity腳本的生命周期，Unity腳本的生命周期如圖3所示。

2.1 試劑：一次性使用采血護(hù)理包，包括碘伏皮膚消毒棉拭（有效碘含量：0.45%～0.55% ，山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司，批號(hào):20191111）；胰酪大豆胨瓊脂（TSA） 表面接觸皿（直徑5.5 cm，采樣面積為23.76 cm2，諾狄生物科技有限公司，批號(hào)：8102200402）；羊血瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20620506）。

2.2 儀器：Autof MS 1000型質(zhì)譜儀（鄭州安圖生物公司）及質(zhì)譜樣本預(yù)處理試劑盒；細(xì)菌培養(yǎng)箱（日本三洋公司），生物安全柜（美國(guó)Thermo 1300 Series A2）。

3 獻(xiàn)血者皮膚消毒程序 每次血液采集前均嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，獻(xiàn)血者皮膚消毒方法均以穿刺點(diǎn)為中心，由里向外呈螺旋形涂抹，采用兩步法操作完成，即使用碘伏涂抹2次，每次作用時(shí)間≥1 min，涂抹面積均為6 cm×8 cm。接觸皿采樣后按照皮膚消毒程序?qū)ΛI(xiàn)血者皮膚再消毒1次。

4 微生物檢測(cè)

4.1 接觸皿采樣法及培養(yǎng)：獻(xiàn)血者皮膚消毒前與消毒后，立即取下TSA平板皿蓋，將培養(yǎng)基凸起面充分接觸待測(cè)手臂皮膚表面，以500 g力按壓接觸皿底部中心10 s，蓋好皿蓋，置（37±1）℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)，計(jì)算細(xì)菌總數(shù)（CFU/cm2）, 將有菌落生長(zhǎng)的平板上的細(xì)菌，根據(jù)各菌落特征及革蘭染色，分別挑取，劃線皿平板培養(yǎng)用于檢測(cè)，所有細(xì)菌操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)將監(jiān)測(cè)的獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的全血制品進(jìn)行隔離。

4.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)及處理：獻(xiàn)血者皮膚消毒后表面菌落數(shù)=培養(yǎng)皿菌落數(shù)/采樣面積（cm2）。參照《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[8]要求，即表面菌落數(shù)≤0.2 CFU/cm2為結(jié)果合格；表面菌落數(shù)＞0.2 CFU/cm2為結(jié)果不合格。細(xì)菌殘留率的計(jì)算方法: 殘留率（%）=（消毒后檢出數(shù)/消毒前檢出數(shù)）×100[9]。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Origin2019軟件制圖，計(jì)量資料服從正態(tài)分布，采用表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，非正態(tài)分布資料采用Wilcoxon檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)（百分比）表示，使用卡方（χ2）檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 獻(xiàn)血者基本資料比較 本次研究共納入200名獻(xiàn)血者作為研究對(duì)象，按照性別、年齡和職業(yè)分組，其中男性組100例（50%），女性組100例（50%）；平均（30±5）歲，≤30歲組90例（45%），＞30歲組110例（55%）；室內(nèi)組121例（60.5%），室外組89例（44.5%）。通過分組后，用卡方檢驗(yàn)分析，3組獻(xiàn)血者的性別、年齡及職業(yè)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 獻(xiàn)血者基本信息（n=200）

2 獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒后表面菌落數(shù)統(tǒng)計(jì) 共對(duì)200名獻(xiàn)血者進(jìn)行手臂皮膚消毒前后監(jiān)測(cè)，經(jīng)分析，獻(xiàn)血者皮膚消毒前與消毒后表面菌落數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），消毒前細(xì)菌菌落數(shù)大于消毒后。以0.2 CFU/cm2作為消毒后皮膚監(jiān)測(cè)合格限，合格率為100%（200/200），見表2。

表2 獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒前后表面菌落數(shù)分布（n=200）

3 消毒前與消毒后手臂皮膚表面微生物的種類分布特征 本次研究在獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒前與消毒后各采樣1次，共獲取400份樣本，經(jīng)過MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定分析后發(fā)現(xiàn)，在消毒前樣本中共檢測(cè)出49種，591株細(xì)菌，其中革蘭陽性菌、革蘭陰性菌占比分別為75.51%（37/49）和24.49%（12/49），在消毒后樣本中共檢測(cè)出19種，60株細(xì)菌，其中革蘭陽性菌、革蘭陰性菌占比分別為84.21%（16/19）和15.79%（3/19）。

4 獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒后細(xì)菌殘留率比較 男性組與女性組、≤30歲組與＞30歲組、室內(nèi)組與室外組的獻(xiàn)血者消毒后細(xì)菌殘留率均小于15%，其中室外組最高，為12.50%（40/320）；室內(nèi)組最低，為7.38%（20/271）。室內(nèi)組消毒后細(xì)菌殘留率明顯低于室外組，P＜0. 05，組間比較有顯著性差異，性別組、年齡組組間無顯著性差異，見表3。

表3 6組獻(xiàn)血者皮膚消毒后細(xì)菌殘留率比較

5 室內(nèi)組與室外組消毒前后手臂皮膚表面微生物的種類分布特征 在消毒前室內(nèi)組中共檢出271株細(xì)菌，其中表皮葡萄球菌、頭葡萄球菌、藤黃微球菌所占比例較高，分別為19.19%（52/271）、16.24%（44/271）、10.70%（29/271）；室外組中共檢出320株細(xì)菌，其中藤黃微球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、所占比例較高，分別是17.50%（56/320）、16.56%（53/320）、13.44%（43/320）。在消毒后室內(nèi)組中共檢出20株細(xì)菌，其中頭葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌所占比例較高，分別為20.0%（4/20）、10.0%（2/20）、10.0%（2/20）；室外組中共檢出40株細(xì)菌，表皮葡萄球菌、頭葡萄球菌、人葡萄球菌所占比例較高，分別是20.0%（8/40）、20.0%（8/40）、10.0%（4/40），見圖1。

圖1 室內(nèi)組與室外組獻(xiàn)血者皮膚消毒前與消毒后微生物構(gòu)成比（%）

6 室內(nèi)組與室外組獻(xiàn)血者消毒后皮膚表面微生物殘留率比較 經(jīng)統(tǒng)計(jì)，室內(nèi)組消毒后殘留率最高是鮑曼不動(dòng)桿菌20.0%（2/10）、洛菲不動(dòng)桿菌20.0%（1/5）、腐生葡萄球菌16.67%（1/6）、枯草芽孢桿菌16.67%（1/6）、短芽孢桿菌16.67%（1/6）、彎曲芽孢桿菌16.67%（1/6）、瘡皰丙酸桿菌16.67%（1/6）。室外組消毒后殘留率最高是環(huán)狀芽孢桿菌50.0%（1/2）、頭葡萄球菌33.33%（8/24）、溶血葡萄球菌33.33%（1/3）。組間比較表明，室外組皮膚消毒后頭葡萄球菌和表皮葡萄球菌的殘留率明顯高于室內(nèi)組，P均＜0. 05，組間殘留率比較有顯著性差異，見圖2。

圖2 室內(nèi)組與室外組微生物消毒后殘留率比較

討論

細(xì)菌殘留引起的感染性輸血反應(yīng)是目前歐美等國(guó)家報(bào)告的與輸血相關(guān)死亡主要原因之一[10-11]。本研究按照《血站技術(shù)操作規(guī)程》2019版的要求使用碘伏消毒劑對(duì)獻(xiàn)血者手臂皮膚穿刺部位執(zhí)行消毒程序[12]，通過對(duì)200名獻(xiàn)血者消毒后皮膚表面菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果全部合格，與消毒前結(jié)果相比，消毒后皮膚表面細(xì)菌菌落數(shù)明顯減少，與香港血液中心使用含碘消毒劑對(duì)獻(xiàn)血者監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)基本一致[13]。

在本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究中，我們對(duì)4342名獻(xiàn)血者皮膚消毒后發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)及溫濕度差異會(huì)導(dǎo)致獻(xiàn)血者皮膚消毒后微生物菌落數(shù)量的改變[14]。除季節(jié)因素外，職業(yè)性質(zhì)導(dǎo)致的工作環(huán)境差異也是最可能影響獻(xiàn)血者皮膚微生物種類與數(shù)量的因素，且該因素在前期已發(fā)現(xiàn)與血液制品中微生物殘留量存在顯著相關(guān)，因此本研究對(duì)這一問題進(jìn)行了驗(yàn)證。

在本研究中，通過采集200份獻(xiàn)血者手臂皮膚消毒后標(biāo)本，使用MALDI-TOF MS細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)室外組手臂皮膚消毒后細(xì)菌檢出率均顯著高于室內(nèi)組，且皮膚微生物結(jié)構(gòu)多樣性高于室內(nèi)組，結(jié)合國(guó)外已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)的使用相同消毒方式對(duì)不同人群皮膚微生物消毒效果存在不一致的現(xiàn)象，如：Byrd等發(fā)現(xiàn)人體表面不同的溫濕度、pH值等對(duì)皮膚菌群結(jié)構(gòu)的影響[6，15]，我們進(jìn)一步對(duì)殘留細(xì)菌分析后發(fā)現(xiàn)，室外組頭葡萄球菌和表皮葡萄球菌的殘留率明顯高于室內(nèi)組，如：Moitinho-Silva等發(fā)現(xiàn)教室外的環(huán)境中葡萄球菌種類和載量數(shù)均高于教室內(nèi)[16]。因此我們推測(cè)工作環(huán)境的差異會(huì)對(duì)獻(xiàn)血者皮膚消毒后殘留細(xì)菌的分類產(chǎn)生影響，室外工作者由于職業(yè)性質(zhì)的原因，比室內(nèi)工作者更容易受到室外不良環(huán)境因素的影響[17]；另外表皮葡萄球菌和頭葡萄球菌對(duì)碘伏消毒劑有抑制作用，這兩種凝固酶陰性葡萄球菌細(xì)菌是人體體表的正常菌群，但在抗菌藥物的濫用等情況下易形成生物膜[18]，從而增加皮膚消毒的難度，可一定概率在臨床上引起輸血傳播細(xì)菌感染，如美國(guó)FDA報(bào)道2015～2019年，由3例因輸注混有凝固酶陰性葡萄球菌污染的血液制品而致死的病例[10]，本研究在2016～2018年單采血小板制品中也有檢出到這兩種細(xì)菌[19]，因此以上兩種細(xì)菌對(duì)血液制品造成的潛在影響，尤其是對(duì)特定患者群體的影響仍值得關(guān)注。

本研究還存在以下不足，研究?jī)H通過獻(xiàn)血者在特定工作環(huán)境下的工作時(shí)長(zhǎng)對(duì)樣本進(jìn)行了室內(nèi)與室外組的簡(jiǎn)單劃分，這導(dǎo)致其他可能對(duì)人群體表微生物產(chǎn)生影響的因素，如生活習(xí)慣、工作場(chǎng)所的微生物種類數(shù)量等，是否對(duì)結(jié)果也存在影響還需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，對(duì)200名獻(xiàn)血者皮膚消毒監(jiān)測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，盡管現(xiàn)用手臂皮膚消毒方式能獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的消毒效果，但消毒后仍有細(xì)菌殘留，殘留率最高的是非發(fā)酵菌屬，其次是芽孢桿菌屬和凝固酶陰性葡萄球菌屬，細(xì)菌殘留率及殘留微生物種類可能與獻(xiàn)血者的工作環(huán)境相關(guān)，室外組消毒后細(xì)菌殘留率明顯高于室內(nèi)組，其中室外組皮膚消毒后頭葡萄球菌和表皮葡萄球菌的殘留率高于室內(nèi)組，本研究也可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)程的制定提供參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突