孫玉軍，馬敬斌，馬海鳳

(聊城市第二人民醫(yī)院兒科，山東 聊城 252600)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是兒童肺炎常見(jiàn)類(lèi)型，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中占比約10%～30%。MPP可進(jìn)一步發(fā)展為重癥MPP，出現(xiàn)肺膿腫、肺不張等肺內(nèi)并發(fā)癥，或累及神經(jīng)、心血管、消化等肺外系統(tǒng)，危及患兒健康與生命[1]。然而，MPP前期癥狀缺乏特異性，臨床常規(guī)病情評(píng)估體系可能存在一定的滯后性，從而影響患兒的及時(shí)治療[2]。因此，探尋MPP的早期客觀(guān)指標(biāo)以輔助臨床評(píng)估，對(duì)及時(shí)干預(yù)治療、改善預(yù)后至關(guān)重要。近年來(lái)，微小RNA(microRNA，miRNA)逐漸被證實(shí)參與許多生物學(xué)過(guò)程[3]。相關(guān)研究表明微小RNA-29c(microRNA-29c，miR-29c)、微小RNA-146a(microRNA-146a，miR-146a)與哮喘、病毒性肺炎等兒童呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4-5]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明miR-146a可調(diào)節(jié)炎癥因子參與MPP發(fā)展[6]。鑒于炎癥反應(yīng)是目前公認(rèn)的MPP重要發(fā)病機(jī)制，既往研究也證實(shí)炎癥因子與MPP兒童密切相關(guān)但受到多因素影響[7]，故本研究結(jié)合miR-29c、miR-146a與炎癥因子相關(guān)性的分析，探討二者與MPP的關(guān)系，旨在為臨床防治提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究為前瞻性研究，選取2018年5月至2020年10月于本院診治的96例MPP患兒為MPP組對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)PP診斷符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第8版)》中標(biāo)準(zhǔn)[8]；②患兒年齡3～12歲；③MPP急性期入院；④患兒家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院7d內(nèi)出現(xiàn)其他細(xì)菌或病毒感染；②伴其他呼吸系統(tǒng)疾病(哮喘、肺結(jié)核等)；③免疫、血液系統(tǒng)疾病及皮膚病、全身過(guò)敏性疾病患兒；④近3個(gè)月有免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗凝藥物應(yīng)用史；⑤心、肝、腎、肺等器質(zhì)性疾病及結(jié)締組織病患兒。另選取同期住院且明確診斷為細(xì)菌性肺炎的69例患兒為細(xì)菌性肺炎組；同期于本院體檢健康的87例兒童作為健康對(duì)照組(年齡3～12歲，排除近6個(gè)月有感染疾病史者及血液、免疫相關(guān)疾病兒童)。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，獲得院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象的家屬均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1外周血miR-29c、miR-146a水平檢測(cè)

急性期MPP、細(xì)菌性肺炎患兒入院后12h內(nèi)采集靜脈血3mL(采血前均未使用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素治療)，健康兒童于體檢當(dāng)天采血3mL，EDTA-K2抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離后加入TRIZOL-80℃存留備測(cè)。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法測(cè)定外周血miR-29c、miR-146a相對(duì)表達(dá)量水平：①提取總RNA，測(cè)定RNA含量，反轉(zhuǎn)錄合成miR-29c cDNA、miR-146a cDNA，試劑供自日本TAKARA公司。②采用7500 FAST型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)對(duì)miR-146a、miR-29c、U6(內(nèi)參)實(shí)施擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix=10μL，上游引物=0.5μL，下游引物=0.5μL，cDNA=1μL，Distillation-Distillation H2O=8μL，總體積=20μL。擴(kuò)增引物序列：miR-29c上游引物序列為GGGTAGCACCATTTGAAA，下游序列為GGGCAATTGCACTGGATAC；miR-146a上游引物序列為CTGGACTGCAAGGAGGGGTC，下游序列為GCAGACTGAAAAAGTTCTT；U6上游引物序列為ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，下游序列為GGA ACGCTTCACGAATTTG。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸15s，共40個(gè)循環(huán)。各反應(yīng)重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct計(jì)算外周血miR-29c、miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2炎癥因子水平檢測(cè)

采集研究對(duì)象入院后12h內(nèi)(急性期MPP、細(xì)菌性肺炎兒童為入院治療前，健康對(duì)照組兒童采血時(shí)間為體檢當(dāng)日)靜脈血3mL，采血1次，離心10 min(3 000 r/min)取上清液，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清白介素-17(interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)水平，試劑供自武漢博士德生物工程有限公司，所有操作嚴(yán)格按步驟遵循試劑盒說(shuō)明完成。

1.2.3 MPP病情判定

依據(jù)《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第8版)》中標(biāo)準(zhǔn)[8]，確診MPP患兒如出現(xiàn)以下“①、②、③”中任2條和(或)“④、⑤”中任1條則判定為重癥MPP：①接受規(guī)范大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥治療>7d仍無(wú)效，或發(fā)熱持續(xù)>10d；②心動(dòng)過(guò)速或氣促明顯(1～5歲和>5歲患兒心率分別為≥140次/min、≥120次/min；呼吸頻率分別為≥40次/min、≥30次/min)，可伴發(fā)紺、鼻扇、血壓降低(收縮壓≤75 mmHg)等；③胸部影像提示大片狀致密影，占據(jù)≥1個(gè)肺葉/肺段，可累及單葉/多葉病變；④存在肺膿腫、肺不張等肺內(nèi)合并癥；⑤發(fā)生嚴(yán)重的低氧血癥(氧分壓<60 mmHg)，或出現(xiàn)心力衰竭、微循環(huán)紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等肺外并發(fā)癥。根據(jù)是否發(fā)生重癥MPP將96例MPP患兒分為重癥組(n=45)和輕癥組(n=51)。

1.3觀(guān)察指標(biāo)

觀(guān)察各組兒童外周血miR-29c、miR-146a水平及IL-17、TNF-α、IL-1β水平；分析miR-29c、miR-146a與炎癥因子相關(guān)性；比較MPP不同病情組患兒的miR-29c、miR-146a水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1三組兒童基線(xiàn)資料的比較

三組兒童性別、年齡、年齡組、體質(zhì)指數(shù)等基線(xiàn)資料間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 三組兒童基線(xiàn)資料的比較

2.2三組兒童外周血miR-29c、miR-146a及炎癥因子水平比較

三組兒童外周血miR-29c、miR-146a水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別是117.929、87.687，P<0.05)，MPP組<細(xì)菌性肺炎組<健康對(duì)照組。三組兒童炎癥因子IL-17、TNF-α、IL-1β水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別是129.282、107.023、386.649，P<0.05)，MPP組>細(xì)菌性肺炎組>健康對(duì)照組，見(jiàn)表2。

表2 三組兒童外周血miR-29c、miR-146a及炎癥因子水平比較

2.3 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子IL-17、TNF-α、IL-1β均呈負(fù)相關(guān)(rmiR-29c分別是-0.512、-0.550、-0.494，rmiR-146a分別是-0.329、-0.282、-0.340，P<0.05)，見(jiàn)表3及圖1。

表3 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關(guān)性

圖1 MPP患兒外周血miR-29c、miR-146a與炎癥因子的相關(guān)性

2.4 MPP不同病情組外周血miR-29c、miR-146a水平比較

MPP重癥組患兒miR-29c和miR-146a水平均低于輕癥組患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別是3.477、3.453，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 MPP不同病情組外周血miR-29c、miR-146a水平比較

3討論

3.1MPP與炎癥因子的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，MPP組患兒的IL-17、TNF-α、IL-1β水平均明顯高于細(xì)菌性肺炎組和健康對(duì)照組兒童。IL-17分泌自Th17促炎細(xì)胞，可經(jīng)中性粒細(xì)胞招募性刺激多類(lèi)炎癥介質(zhì)釋放，在MPP中水平增高。既往研究也表明急性期MPP的IL-17水平相比正常者升高，且在合并肺外并發(fā)癥組中升高顯著[9]。MPP可刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，過(guò)量TNF-α可誘發(fā)免疫損害、內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼而參與肺外系統(tǒng)受損，因此TNF-α與MPP病情有關(guān)。既往臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明TNF-α有助于MPP評(píng)估[10-11]。IL-1β是主要分泌自巨噬細(xì)胞的促炎因子，可影響免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、感染過(guò)程等。蔡辰等人研究表明重癥MPP組血清IL-1β相比非重癥MPP組高[12]，說(shuō)明IL-1β可反映MPP病情。

3.2研究MPP客觀(guān)標(biāo)志物的必要性及意義

MPP發(fā)生過(guò)程可激活免疫細(xì)胞，促使大量炎癥因子釋放，參與MPP發(fā)展。但炎癥因子受到多因素調(diào)節(jié)和影響，對(duì)MPP兒童病情的反映可能存在滯后性，加之MPP病因機(jī)制復(fù)雜，目前臨床對(duì)客觀(guān)指標(biāo)的探尋尚不全面。蔡辰等[12]研究也指出，細(xì)胞因子水平對(duì)重癥MPP缺乏診斷效能，在臨床應(yīng)用中難以預(yù)測(cè)重癥MPP。因此，探尋更多潛在標(biāo)志物輔助臨床MPP的客觀(guān)評(píng)估，從而為MPP的防治提供導(dǎo)向，具有重要研究意義。

3.3 MPP患兒miR-29c表達(dá)及與炎癥因子的相關(guān)性

miR-29c在機(jī)體免疫應(yīng)答、感染疾病中有重要意義。Zhang等人研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，哮喘加重患兒的miR-29c水平明顯降低[13]；另有資料顯示miR-29c在呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程中參與作用[14]。然而miR-29c與MPP的相關(guān)研究尚少。本研究顯示MPP患兒外周血miR-29c水平低于細(xì)菌性肺炎組和健康對(duì)照組，且MPP重癥組低于輕癥組，說(shuō)明miR-29c在MPP患兒中呈相對(duì)低水平，且與MPP病情有關(guān)。這可能與miR-29c調(diào)控T細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)抗感染免疫反應(yīng)等有關(guān)[15]。既往研究表明，MPP感染患兒免疫功能紊亂，Th1細(xì)胞受抑制，Th1/Th2喪失平衡[16]；此外，Li等人[17]的研究顯示與對(duì)照組相比，MPP患兒的miR-29c水平明顯降低，而可溶性B7-H3、IL-17水平明顯升高；B7-H3是miR-29c的直接靶標(biāo)，miR-29c沉默會(huì)上調(diào)B7-H3的表達(dá)，因此miR-29c可能是防治MPP的新靶標(biāo)。這可能是miR-29c水平可反映MPP患兒病情的重要原因。本研究相關(guān)性分析顯示miR-29c與IL-17負(fù)相關(guān)，與上述發(fā)現(xiàn)較為一致。

3.4 MPP患兒miR-146a表達(dá)及與炎癥因子的相關(guān)性

miR-146a是核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通道依賴(lài)型的具有抗炎特性的miRNA。既往研究表明miR-146a與呼吸窘迫綜合征、急性肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病具有關(guān)聯(lián)性[18-19]。本研究顯示MPP患兒的miR-146a水平低于細(xì)菌性肺炎組和健康對(duì)照組，且MPP重癥組低于輕癥組，說(shuō)明MPP患兒miR-146a呈相對(duì)低水平，且與MPP病情有關(guān)。究其原因，miR-146a可抑制Toll樣受體4調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，提高M(jìn)2基因表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞促炎因子的釋放[20]；而低miR-146a水平預(yù)示機(jī)體抵抗能力和抗炎作用減弱，宿主反應(yīng)失調(diào)，炎癥及免疫損害增加，進(jìn)而參與病情進(jìn)展。Li等人[21]研究表明難治性MPP中miR146a5p的表達(dá)降低，可誘導(dǎo)ATP結(jié)合盒亞家族G成員1和白介素1受體相關(guān)激酶1的蛋白質(zhì)表達(dá)，與MPP發(fā)展有關(guān)。另一方面，研究顯示miR-146a可負(fù)性調(diào)控IL-1β等介導(dǎo)的白介素-6、環(huán)氧化酶-2的負(fù)性影響及炎癥反應(yīng)[22]。這可能是miR-146a與MPP相關(guān)聯(lián)的機(jī)制之一，同時(shí)提示miR-146a與IL-1β等炎癥因子存在關(guān)聯(lián)性。國(guó)內(nèi)報(bào)道顯示miR-146a與TNF-α、IL-1β呈負(fù)相關(guān)[23]；本研究也發(fā)現(xiàn)miR-146a與IL-17、TNF-α、IL-1β均呈負(fù)相關(guān)，間接提示了miR-146a監(jiān)測(cè)的可行性及價(jià)值。國(guó)外一項(xiàng)研究也表明社區(qū)獲得性肺炎入院時(shí)高水平的miR-146a與較低的30天死亡率相關(guān)，可作為預(yù)后生物標(biāo)志物[24]，但具體方案有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。

綜上所述，MPP兒童外周血miR-29c、miR-146a呈相對(duì)低水平，且與IL-17、TNF-α、IL-1β呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；miR-29c、miR-146a可能參與MPP發(fā)病過(guò)程，其水平隨病情加重而降低。但本研究屬于單中心研究，樣本量不大，后續(xù)尚待大樣本量研究進(jìn)一步予以驗(yàn)證。