劉亞粉 張 青 楊洞洞

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

癲癇是一種以反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作（spontaneous recurrent seizures，SRS）為特征的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前,癲癇的治療以抗發(fā)作藥物（anti-seizure medications，ASMs）控制SRS為主，并不能從根本上治療癲癇，且近30%的患者對(duì)ASMs治療無(wú)效[1]，容易出現(xiàn)抑郁、焦慮、認(rèn)知障礙、睡眠障礙和偏頭痛等共患病[2]。因此，迫切需要根據(jù)癲癇的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尋找新的治療藥物或策略。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可以通過(guò)受體-配體通路抑制癲癇的發(fā)生，這可能成為癲癇潛在的治療靶點(diǎn)。柴貝止癇顆粒是臨床經(jīng)驗(yàn)用方，其對(duì)癲癇的治療安全有效[3]，然而其抗癲癇發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制尚未明確。本研究模擬常見(jiàn)癲癇綜合征顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，通過(guò)觀察大鼠行為學(xué)、海馬BDNF及其受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、下游信號(hào)分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的表達(dá)，探討柴貝止癇顆粒對(duì)TLE的療效及可能的作用機(jī)制，為尋找中藥復(fù)方干預(yù)癲癇的新靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量220～250g（許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。飼養(yǎng)條件：室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照周期12小時(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：海人酸（kainic acid，KA）（Med Chem Express，cas：487-79-6）；地西泮注射液（2ml：10mg/支，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H31021864）；柴貝止癇顆粒（浙江景岳堂藥業(yè)有限公司制備，方中柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣、地龍的比例為4∶5∶3∶3∶3∶10∶2，1g顆粒劑相當(dāng)于原生藥9.73g）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：腦立體定位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司，SA-102）；微量注射泵（KD Scientific，LEGATO 130）。Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（中杉金橋，TA-08，1/2000）；Rabbit Anti BDNF（Abcam，ab108319，1/1000）；Rabbit Anti TrkB (Abcam，ab187041，1/5000）；Rabbit Anti PI3K (Abcam，ab191606，1/1000）。

1.4 造模及干預(yù)方法：分述如下。

1.4.1 動(dòng)物分組：50只SD大鼠，假手術(shù)組10只，其余進(jìn)行TLE造模，TLE模型大鼠隨機(jī)分為模型組和治療組。

1.4.2 建立模型：大鼠麻醉后備皮，固定于腦立體定位儀，以Bragma點(diǎn)作為三維坐標(biāo)系的參考零點(diǎn)，確定SD大鼠右側(cè)側(cè)腦室坐標(biāo)（側(cè)腦室：x=-1.6mm，y=-0.8mm，z=-3.8mm）。標(biāo)記側(cè)腦室后，牙科鉆鉆孔，模型組和給藥組微量注射器注射海人酸（濃度0.5μg/μl），注射3μl，注射速度為1μl/min，留針5min，緩慢退針。大鼠蘇醒后觀察1小時(shí)，按Racine[4]分級(jí)判定發(fā)作的級(jí)別，4～5級(jí)發(fā)作反復(fù)出現(xiàn)持續(xù)1小時(shí)視為造模成功，否則棄用。1小時(shí)后給予大鼠地西泮注射液（0.1mg/kg）腹腔注射終止發(fā)作。假手術(shù)組予同等方法注射同等劑量的生理鹽水。

1.4.3 藥物干預(yù)：造模第一天起治療組給予柴貝止癇顆粒0.96g/kg/d灌胃（給藥劑量按動(dòng)物體表面積以成人用量換算，給藥體積為10ml/kg·d），模型組和假手術(shù)組給予蒸餾水灌胃（10ml/kg·d）。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法：分述如下。

1.5.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察：每組隨機(jī)選取3只大鼠，于造模后11w進(jìn)行視頻監(jiān)測(cè)1w，記錄各組大鼠發(fā)作次數(shù)、每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間，計(jì)算平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間=每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間之和/總發(fā)作次數(shù)。

1.5.2 標(biāo)本采集：每組隨機(jī)選取3只大鼠分別于造模后2d、10d取材，進(jìn)行視頻監(jiān)測(cè)的大鼠于造模后12w取材，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，鍘刀斷頭取出腦組織，置冰上，分離海馬組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）：取海馬組織放入研磨器中，加入液氮研磨成粉末后，加入裂解液，4℃裂解30min，在10000rpm/min離心10min，吸取上清液即得總蛋白；利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；蛋白變性、上樣、電泳1～2h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50min；相應(yīng)一抗、二抗孵育后，ECL曝光；用“Quantityone”軟件分析BDNF、TrkB、PI3K、GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布用（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析，兩兩比較選用LSD法。設(shè)置雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)：各組大鼠總發(fā)作次數(shù)、平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較：見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠總發(fā)作次數(shù)、平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較（±s）

表1 各組大鼠總發(fā)作次數(shù)、平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05。

組別模型組治療組平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間（秒）43.00±4.58 33.33±3.79#總發(fā)作次數(shù)（次）46.00±7.00 32.00±4.36#

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達(dá)比較：見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達(dá)比較（±s，目標(biāo)蛋白/GAPDH OD值）

表2 各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達(dá)比較（±s，目標(biāo)蛋白/GAPDH OD值）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2d 10d 12w組別假手術(shù)組模型組治療組PI3K 0.62±0.06 0.68±0.06 0.71±0.07 BDNF 1.36±0.14 1.02±0.10*1.02±0.10*TrkB 1.54±0.15 1.32±0.13 0.89±0.09#PI3K 0.96±0.10 1.08±0.11 0.94±0.09 BDNF 1.00±0.10 0.99±0.10 1.16±0.12 TrkB 1.58±0.16 1.63±0.16 1.68±0.17 PI3K 1.14±0.11 1.36±0.14 1.43±0.14 BDNF 0.96±0.09 0.75±0.07*1.28±0.12*#TrkB 0.94±0.09 0.92±0.09 1.03±0.10

圖1 WB檢測(cè)各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K的表達(dá)

3 討論

TLE屬于中醫(yī)學(xué)癇病范疇，病位主要涉及肝、腦，病理因素以郁、風(fēng)、痰為主。其反復(fù)發(fā)作、經(jīng)久難愈可能與氣郁久滯、頑痰難化有關(guān)[5]。因此，柴胡劑廣泛用于癇病的治療[6,7]。柴貝止癇顆粒是在《傷寒論》柴胡加龍骨牡蠣湯和《醫(yī)學(xué)心悟》定癇丸的基礎(chǔ)上加減化裁而成，制成顆粒劑更方便臨床應(yīng)用。方中柴胡為君，苦辛而微寒，疏肝解郁、條達(dá)肝氣，使肝風(fēng)易止、痰郁得散；天麻性味甘平，熄風(fēng)止痙、平肝潛陽(yáng)，浙貝母苦寒，化痰清熱散結(jié)，半夏辛溫，燥濕化痰，共為臣藥；牡蠣、地龍咸寒，熄風(fēng)定驚、軟堅(jiān)散結(jié)，共為佐藥；石菖蒲引藥入腦絡(luò)，并制他藥之寒涼，兼為佐使。諸藥合用，共奏疏肝理氣、化痰熄風(fēng)、醒神開(kāi)竅之功。本研究發(fā)現(xiàn)，柴貝止癇顆?？蓽p少TLE大鼠發(fā)作次數(shù)、降低平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間，提示該顆粒劑對(duì)TLE具有一定的治療效果。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員之一，TrkB是BDNF的高親和力受體，PI3K是BDNF-TrkB下游的信號(hào)通路之一。許多細(xì)胞和動(dòng)物研究表明，BDNF水平降低與癲癇發(fā)病率增加有關(guān)[8]，BDNF-TrkB信號(hào)的缺失可導(dǎo)致SRS[9]，BDNF可通過(guò)降低GABA能神經(jīng)元興奮性[10]、減輕癲癇發(fā)生相關(guān)的炎癥反應(yīng)[11]抑制癲癇。臨床研究也證實(shí)BDNF水平的降低與癲癇的發(fā)生之間存在直接關(guān)系[12]。本研究中模型組大鼠海馬BDNF在TLE急性期（造模后2d）、慢性期（造模后12w）均降低，驗(yàn)證了BDNF在TLE發(fā)生發(fā)展中的作用。然而TrkB、PI3K未表現(xiàn)出與TLE的相關(guān)性，提示BDNF可能通過(guò)其他靶點(diǎn)參與TLE的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)柴貝止癇顆粒治療12w后，可提高BDNF的表達(dá)，這可能是該顆粒劑干預(yù)癲癇的機(jī)制之一。柴貝止癇顆?？梢宰鳛橐环N新型的癲癇治療措施應(yīng)用于臨床，但該顆粒劑通過(guò)提高BDNF抑制癲癇發(fā)生的確切分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。