劉照振,寇晉萍,劉海濤,侯金鳳,齊麟,黃曉春,李彧,劉琦,車寶泉（北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

氨基糖苷類抗生素主要對金黃色葡萄球菌和需氧革蘭陰性桿菌，包括銅綠假單胞菌有強大的抗菌作用；對沙雷菌屬、布魯桿菌、沙門桿菌、嗜血桿菌、痢疾桿菌以及結(jié)核分枝桿菌、其他分枝桿菌屬亦具有良好的抗菌作用。氨基糖苷類抗生素優(yōu)點較多，如水溶性好、抗菌能力強、性質(zhì)穩(wěn)定、吸收排泄較好等，因此在臨床上應用較為廣泛[1]?？敲顾兀╧anamycin）是1958年日本明治制果藥業(yè)株式會社開發(fā)生產(chǎn)的由α-去氧鏈胺衍生物組成的氨基糖苷類抗菌藥，對革蘭陰性菌及青霉素、鏈霉素、紅霉素等產(chǎn)生耐藥性的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌、肺炎桿菌和痢疾桿菌有很強的抗菌作用[2]。目前各國藥典對卡那霉素均有收錄[3-7]，其原料藥根據(jù)硫酸鹽數(shù)目不同分為單硫酸卡那霉素（C18H36N4O11·H2SO4）和硫酸卡那霉素（C18H36N4O11·xH2SO4）兩種[8]。據(jù)文獻報道，卡那霉素主成分為卡那霉素A，發(fā)酵和純化工藝中會產(chǎn)生卡那霉素B、卡那霉素D等副產(chǎn)物和脫氧鏈霉胺降解產(chǎn)物[9-10]。

卡那霉素缺乏特征的紫外吸收，因此一般采用蒸發(fā)光檢測器（HPLC-ELSD）法對其進行質(zhì)量控制?！吨袊幍洹?020年版[7]（Ch.P2020）收載的硫酸卡那霉素原料及硫酸卡那霉素注射液有關(guān)物質(zhì)測定方法均為HPLC-ELSD法，僅對雜質(zhì)卡那霉素B進行檢查，未對其他雜質(zhì)進行控制，并且也有文獻[10]采用ELSD方法對其他雜質(zhì)的控制進行研究，由于ELSD要求流動相具有揮發(fā)性，使得色譜系統(tǒng)的優(yōu)化受到限制，因此分離能力較差。除《中國藥典》2020年版外，各國藥典均采用薄層色譜法進行有關(guān)物質(zhì)檢查，方法專屬性較差且分離能力較低，無法對雜質(zhì)譜進行深入分析。近幾年已有文獻[10-14]相繼報道，采用高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法對硫酸卡那霉素滴眼液、硫酸異帕米星注射液、妥布霉素滴眼液等氨基糖苷類制劑的質(zhì)量控制方法展開研究。因此，針對硫酸卡那霉素原料及注射液需要開發(fā)新的質(zhì)量控制方法。本方法重點參考文獻[10-14]，在原有文獻報道的高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測法的基礎(chǔ)上，調(diào)整色譜系統(tǒng)和柱后衍生化系統(tǒng)，增加系統(tǒng)載樣量，提高檢測靈敏度和雜質(zhì)分離度，新驗證的方法相比《中國藥典》2020年版和文獻方法，雜質(zhì)的分離更好，檢測靈敏度和測定準確度進一步提高，可更好地控制硫酸卡那霉素原料及注射液的質(zhì)量。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器 LC-20A高效液相色譜儀（島津公司）；RF-20A熒光檢測器（島津公司）；waterse2695高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）；2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）（奧泰公司）；Pickering PCX 5200柱后衍生化系統(tǒng)（美國沃特斯公司）；XA205電子天平（Mettler-toleto公司）等。

1.2 藥品與試劑 硫酸卡那霉素對照品（批號：130556-201502，中國食品藥品檢定研究院）；卡那霉素B對照品（批號：130548-200501，中國食品藥品檢定研究院）；硫酸卡那霉素樣品A（A公司，批號：180601、180602、181103），單硫酸卡那霉素樣品B（B公司，批號：20120112-1、20120203-1），單硫酸卡那霉素樣品C（C公司，批號：D1405020、D1405022），硫酸卡那霉素注射液樣品D（D公司，批號：1306171、1306172），硫酸卡那霉素注射液樣品F（F公司，批號：13091301、13091303）；氫氧化鈉、硼酸、冰醋酸、2-巰基乙醇（分析純）、無水硫酸鈉由國藥集團化學試劑有限公司提供（分析級）；鄰苯二甲醛（色譜純）由北京百靈威科技有限公司提供；三氟醋酸由J＆K CHEMICL提供（色譜級）；三氟乙酸、乙腈、甲醇均為色譜純，購自Merck公司；庚烷磺酸鈉（色譜純）由北京百靈威科技有限公司提供；水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：pH3.4緩沖液（取庚烷磺酸鈉一水合物8.7g和無水硫酸鈉32g，加水溶解并稀釋至2000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.4±0.1）-甲醇（95∶5）為流動相A，以甲醇為流動相B，按表1進行線性梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長455nm；進樣體積：5μL。配有柱后衍生化裝置，衍生化試液：取鄰苯二醛0.8g、甲醇300mL、2-巰基乙醇2ml和硼酸緩沖液（取72.0g硼酸和43.0g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至4000mL，用1mol/L硼酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10.4±0.1）700mL，混合，搖勻，置棕色瓶中，避光儲存；衍生化溫度：35℃；衍生化試液流速：0.5mL/min。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備 有關(guān)物質(zhì)測定溶液：精密稱取硫酸卡那霉素適量或精密量取硫酸卡那霉素注射液適量，加水溶解并定量稀釋制成約含卡那霉素1mg/ml的溶液，作為有關(guān)物質(zhì)供試品溶液。取卡那霉素對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成約含卡那霉素2.5、5、10、15和20μg/mL的溶液，作為對照溶液（1）、（2）、（3）、（4）和（5），用線性回歸方程以自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)含量。

2.3 系統(tǒng)適用性溶液 系統(tǒng)適用性試驗溶液：取卡那霉素B對照品約10mg，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為卡那霉素B對照品貯備液；另取卡那霉素對照品B約10mg，置10mL量瓶中，精密量取卡那霉素B對照品貯備液1ml，置同一量瓶中，振搖使其溶解，加水稀釋至刻度線，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

將系統(tǒng)適用性溶液照“2.1”項下條件分析，與采用《中國藥典》2020年版中的HPLC-ELSD法比較，結(jié)果詳見圖1與圖2，如圖2所示采用新的方法，卡那霉素峰與卡那霉素B，及各雜質(zhì)峰之間分離度更能滿足藥典要求。

圖1 HPLC-熒光檢測法系統(tǒng)適用性典型色譜圖

圖2 《中國藥典》2020年版HPLC-ELSD法測定系統(tǒng)適用性典型色譜圖

2.4 專屬性試驗 按企業(yè)提供的制劑處方，稱取亞硫酸氫鈉約2.0g、依地酸二鈉0.1g，置同一1000ml量瓶中，加入適量純化水使溶解，另加入濃硫酸27.6ml，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置250ml量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，作為輔料干擾溶液。將輔料干擾溶液和空白溶劑照“2.1”項下條件分析，結(jié)果詳見圖3。如圖所示，空白與輔料均不干擾樣品測定，方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗色譜圖。注：A.空白；B.輔料

2.5 破壞試驗 取D企業(yè)批號為1306171的樣品，精密量取5份，各1mL，分別置250mL量瓶中，進行如下處理：①酸破壞：加2mol/mL鹽酸溶液5mL，60℃水浴加熱12h，加2mol/mL氫氧化鈉溶液5mL中和；②堿破壞：加2mol/mL氫氧化鈉溶液5mL，60℃水浴加熱12h，加5mol/mL鹽酸溶液1mL中和；③光破壞：在5000lx照度下放置12h；④熱破壞：60℃水浴加熱12h；⑤氧化破壞：加6%過氧化氫溶液5mL，60℃水浴加熱12h。將上述5種破壞的溶液用水稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下條件進樣分析，色譜圖詳見圖4。結(jié)果表明，在硫酸卡那霉素光照和加熱破壞下均穩(wěn)定，在堿和氧化條件下，降解雜質(zhì)Ⅱ和雜質(zhì)Ⅲ的含量略有上升，在酸性破壞中降解雜質(zhì)Ⅱ和雜質(zhì)Ⅲ的含量有明顯上升。由結(jié)果可以看出，卡那霉素在各條件破壞下得到的雜質(zhì)均能實現(xiàn)滿意分離。

圖4 樣品原液及5種方式破壞樣品溶液的色譜圖。注：A.未破壞；B.加熱破壞；C.光照破壞；D.氧化破壞；E.堿破壞；F.酸破壞

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱定硫酸卡那霉素對照品適量，用水溶解并稀釋制成約1.0mg/mL的卡那霉素溶液，作為線性儲備液。分別精密量取線性儲備液適量，制成系列濃度的線性溶液，作為線性考察用溶液。分別取線性考察溶液5μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以卡那霉素峰面積y對質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，得出回歸方程：y=43.415x-15.627（r＝0.9998）結(jié)果表明卡那霉素在0.005-1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，與卡那霉素峰面積呈良好線性。

2.7 檢測限和定量限 熒光方法的最低檢測濃度為0.3μg/mL（LOD，S/N=3），最低定量濃度0.5μg/mL（LOQ，S/N=10），按進樣量5μL換算，得到方法的檢測限為1.5ng，定量限為2.5ng，分別相當于供試品濃度的0.03%和0.05%。

2.8 重復性考察 取批號為1306171的樣品，按2.2項下方法配制供試品溶液各6份，照2.1項下的方法色譜條件，在10h內(nèi)每2h進樣，分別測定其已知雜質(zhì)、其他單個最大雜質(zhì)和總雜質(zhì)的量，結(jié)果詳見表2：卡那霉素B的RSD（n=6）為0.5%，雜質(zhì)Ⅰ的RSD（n=6）為0.4%，雜質(zhì)Ⅱ的RSD（n=6）為0.8%，雜質(zhì)Ⅲ的RSD（n=6）為1.3%，雜質(zhì)Ⅳ的RSD（n=6）為1.0%，總雜質(zhì)的RSD（n=6）為0.3%，表明重復性良好。

表2 重復性試驗結(jié)果

2.9 耐用性試驗 對方法的耐用性進行分析，分別改變流速、柱溫、流動相pH值和相同色譜柱的批次，以卡那霉素峰與卡那霉素B峰之間、卡那霉素與雜質(zhì)Ⅳ、雜質(zhì)Ⅱ分別與雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅲ之間分離度衡量分離情況，耐用性試驗結(jié)果見表3。由結(jié)果可見，最優(yōu)條件為1.0mL/min流速，35℃柱溫，流動相為pH值為3.4。

表3 耐用性試驗結(jié)果

2.10 有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果 分別取各企業(yè)硫酸卡那霉素原料及注射液，按“2.2”項下方法配制有關(guān)物質(zhì)供試品溶液及有關(guān)物質(zhì)對照品溶液，按照“2.1”項下條件分析。計算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表4。

表4 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本文重點參考硫酸卡那霉素滴眼液質(zhì)量控制相關(guān)文獻[12-14]，采用高效液相色譜-柱后衍生化-熒光檢測器法，新建硫酸卡那霉素原料及注射液有關(guān)物質(zhì)的測定方法。在已有文獻方法的基礎(chǔ)上，調(diào)整色譜系統(tǒng)和衍生化條件。

在液相色譜條件方面：在不改變流動相中緩沖鹽的情況下，進一步調(diào)整流動相中緩沖鹽和乙腈的比例，并相應地調(diào)整梯度洗脫時間程序，色譜柱由（4.6mm×100mm，3.5μm）的短柱，改變?yōu)锳gilent ZORBAX SB C18（4.6mm×250mm，5μm）長柱。

柱后衍生化條件：在不改變柱后衍生化試劑、緩沖鹽等條件下，充分考察了衍生劑的流速、衍生化的溫度、衍生化試劑的用量和衍生劑的pH值等方面的因素。在衍生劑的流速方面，衍生劑流速影響衍生化率，在流速0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min時主峰面積無明顯變化，當衍生劑流速增大到0.6-1.0mL/min時，主峰面積呈現(xiàn)減小趨勢，但是各雜質(zhì)分離度隨衍生劑流速增大而提高，因此綜合考慮各色譜峰分離度和衍生化率的因素，衍生劑流速確定為0.5mL/min；衍生化試劑鄰苯二甲醛用量方面，衍生劑加入量在1.2g/L、1.0g/L、0.9g/L、0.8g/L和0.7g/L時各峰面積無明顯變化，當衍生劑加入量減少至0.6g/L和0.5g/L時，各峰面積呈現(xiàn)減小趨勢，因此綜合考慮衍生化率，衍生劑加入量確定為0.8g/L；考察了衍生劑不同pH值時（10.2、10.4、10.6）和衍生化溫度（30℃、35℃、40℃）各峰面積的變化，溫度和pH值的變化對峰面積幾乎無影響，故選擇與文獻相同的衍生化溫度為35℃和pH值10.4。

3.2 雜質(zhì)定位及計算方法選擇 中檢院提供的卡那霉素B為定性鑒別用對照品，缺乏純度值，雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ各國藥典均未有相關(guān)對照品，無法進行雜質(zhì)回收率的準確度試驗，也無法按雜質(zhì)對照外標法或帶校正因子的自身對照法計算。此外，《中國藥典》2020年版也采用不帶校正因子的自身對照法，其他各國藥典均采用自身對照的薄層色譜法進行有關(guān)物質(zhì)檢查，因此受各國藥典無對照品的限制，新建方法也采用不帶校正因子的自身對照法計算。

3.3 新建方法與《中國藥典》現(xiàn)行標準有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果的比較 用新建硫酸卡那霉素及注射液有關(guān)物質(zhì)的測定方法與《中國藥典》2020年版收載硫酸卡那霉素有關(guān)物質(zhì)測定方法HPLCELSD，分別對企業(yè)提供樣品進行測試，測試樣品的代表性圖譜詳見圖5和圖6，樣品測定結(jié)果詳見表5。

表5 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法（新擬定方法）和HPLCELSD（中國藥典方法）有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果對比

圖5 HPLC-ELSD系統(tǒng)有關(guān)物質(zhì)測定法供試品溶液實驗色譜圖

圖6 HPLC-柱后衍生化-熒光檢測系統(tǒng)有關(guān)物質(zhì)測定法供試品溶液實驗色譜圖

根據(jù)測定結(jié)果，HPLC-FLD法檢出雜質(zhì)數(shù)量更多（見表5）；對于樣品中主要的降解雜質(zhì)Ⅱ與雜質(zhì)Ⅲ和工藝雜質(zhì)Ⅰ，HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法都能實現(xiàn)更好的分離和檢測（見圖6），因此，本法更能真實、客觀、有效地反映出硫酸卡那霉素的質(zhì)量。

4 小結(jié)

本研究是國家藥典委員會關(guān)于硫酸卡那霉素原料及硫酸卡那霉素注射液藥品標準提高項目，本文所建立的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法較HPLC-ELSD法（《中國藥典》2020年版）提高了分離度和靈敏度，新方法測定硫酸卡那霉素原料及注射液的有關(guān)物質(zhì)，檢出雜質(zhì)數(shù)量更多，結(jié)果更加準確。因此，本文建立的HPLC-柱后衍生化-熒光檢測法更能有效控制硫酸卡那霉素原料及注射液的質(zhì)量。