臧文紅，杜洪靈，蔡驍垚，金姝1，

1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421001；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200060

眾所周知，宮頸高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致90%以上的宮頸癌，而對(duì)導(dǎo)致宮頸HR-HPV 持續(xù)感染的原因尚不清楚，國(guó)內(nèi)外大量的研究發(fā)現(xiàn)陰道乳酸菌減少、細(xì)菌多樣性增加與其有密切關(guān)系[1-2]，罕見(jiàn)報(bào)道陰道酸堿度變化對(duì)其影響。足夠的證據(jù)表明酸化作用對(duì)單純皰疹病毒、淋球菌等性傳播病原體及細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）相關(guān)厭氧菌都有明確的殺滅抑制作用[3-4]。HR-HPV 是陰道眾多病原菌之一，他們有共同的陰道環(huán)境。本研究選取2019 年4—8 月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦科門診要求體檢的符合入選條件的女性150 例，剔除陰道細(xì)菌DNA提取擴(kuò)增不達(dá)標(biāo)樣本后以102例樣本測(cè)序納入研究，分析宮頸HR-HPV 感染、陰道菌群、酸堿度三者之間的關(guān)系，以期探討HR-HPV 持續(xù)感染的原因，為清除HPV 感染提供新思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院婦科門診要求體檢的女性150 例。研究經(jīng)上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情同意。根據(jù)宮頸HR-HPV檢測(cè)結(jié)果將至少檢出1種HR-HPV者定義為HPV 陽(yáng)性，未檢出HR-HPV 者定義為HPV 陰性。將成功測(cè)序的102 例患者分為HPV 陽(yáng)性組（n=37）和HPV 陰性組(n=65)。HPV 陽(yáng)性組20～52 歲，平均年齡（33.08±9.12）歲；HPV 陰性組23～51 歲，平均年齡（35.77±8.10）歲。兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具有可比性。陰道液pH≤4.1 為正常，pH≥4.4為升高。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)規(guī)律，有性生活史，年齡＞18歲；②月經(jīng)干凈1 周,無(wú)性生活，無(wú)陰道沖洗上藥；③近1 個(gè)月無(wú)全身或局部應(yīng)用抗生素、激素；④無(wú)外陰瘙癢，無(wú)白帶增多、異味，無(wú)陰道異常出血；⑤無(wú)宮內(nèi)節(jié)育器。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠婦女；②糖尿病患者及肝腎功能不全患者；③有惡性腫瘤史患者。

1.3 方法

①樣本采集：用一次性無(wú)菌擴(kuò)陰器擴(kuò)張陰道，充分暴露宮頸，用無(wú)菌棉拭子繞宮頸旋轉(zhuǎn)擦拭陰道穹隆3 周，采集時(shí)禁忌碰觸其他部位避免污染。采集好的拭子放置在干燥無(wú)菌試管中置于陰涼干燥處，2 h 內(nèi)剪切下棉頭置于專用試管內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃液氮冰箱凍存。之后取一根棉拭子置于陰道穹隆浸濕，取出后轉(zhuǎn)移至pH 試紙，比色并記錄pH 值。最后取專用無(wú)菌刷按說(shuō)明書(shū)采集宮頸細(xì)胞樣本保存，送該院病理科行HR-HPV 檢測(cè)。②宮頸HR-HPV 檢測(cè)：使用上海之江生物科技股份有限公司出品的HPV分型核酸測(cè)定試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，按照說(shuō)明書(shū)分型檢測(cè)16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82 共計(jì)15 個(gè)亞型。③陰道pH 值測(cè)定：使用上海三愛(ài)思試劑有限公司生產(chǎn)的pH3.8～5.4 精密試紙。④陰道細(xì)菌DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、測(cè)序：將-80℃冰箱標(biāo)本批量取出后，放置干冰轉(zhuǎn)運(yùn)箱中，運(yùn)送至上海鯨舟基因科技有限公司。標(biāo)本解凍、離心后按標(biāo)準(zhǔn)流程抽取DNA，對(duì)16s rDNA 的V3+V4區(qū)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。僅以評(píng)級(jí)A 的樣本102 個(gè)進(jìn)行下一步測(cè)序。PCR 試驗(yàn)采用Trans-Gen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl 反應(yīng)體系。參照Illumina 測(cè)序平臺(tái)的正規(guī)操作步驟，將純化定量后的擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建Miseq 文庫(kù)，使用Illumina 公司的測(cè)序平臺(tái)Miseq PE300 進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)Silva132/16s-bactera 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用RDP classifer 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行物種注釋，并在門、綱、目、科、屬各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。豐度＜0.01%的物種合并為其他。

1.4 觀察指標(biāo)

①比較兩組陰道微生物群落物種組成、豐度和多樣性差異。計(jì)算樣本菌群豐度的指數(shù)有Chao、Ace，用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)；用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)有Shannon、Simpson，Shannon 指數(shù)越大，物種多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反。本測(cè)序覆蓋率99.9%；②陰道酸堿度升高、HPV 感染、陰道菌群結(jié)構(gòu)三者的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

利用R 軟件分析作圖，物種累積曲線判斷樣本量充分，稀釋曲線判斷樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。α 多樣性指數(shù)（chao、ace、shannon、simpson）分析判斷樣本微生物群落的豐度和多樣性。根據(jù)OTU 注釋結(jié)果分別在門、綱、目、科、屬各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)組間物種組成和相對(duì)豐度，使用R 軟件用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析判斷組間菌種差異。采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，方差相等，采用（±s）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組陰道細(xì)菌菌群豐度和多樣性比較

兩組陰道菌群豐度和菌群多樣性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組陰道細(xì)菌菌群豐度和多樣性指數(shù)比較(±s)

表1 兩組陰道細(xì)菌菌群豐度和多樣性指數(shù)比較(±s)

指數(shù)Ace Chao Shannon Simpson HPV陽(yáng)性組（n=37）92.154±54.156 83.274±55.891 1.178±0.558 0.483±0.236 HPV陰性組（n=65）93.686±64.934 83.577±61.471 1.039±0.579 0.542±0.237 t值-0.121-0.025 1.182-1.211 P值0.904 0.980 0.240 0.229

2.2 兩組陰道細(xì)菌物種組成

兩組陰道細(xì)菌在門水平的物種組成：HPV 陽(yáng)性組和HPV 陰性組都以厚壁菌門為主（76.91% vs 80.82%）（P=0.197），其次是放線菌門（13.24% vs 11.51%）（P=0.099）、變形菌門（2.94% vs 4.30%）（P=0.862）、擬桿菌門（3.89% vs 1.96%）（P=0.405）和梭桿菌門（2.57%vs 1.01%）（P=0.469）。差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 兩組樣本門水平物種組成柱狀圖

兩組陰道細(xì)菌在屬水平的物種組成：HPV 陽(yáng)性組和HPV 陰性組均以乳酸桿菌為主，占比接近（73.60% vs 75.37%）（P=0.221）。其次是加德納菌（10.37% vs 7.48%）（P=0.073）、小球藻（3.50% vs 1.46%）（P=0.181）、斯內(nèi)西亞菌（2.56% vs 1.00%）（P=0.264）、奇異菌（2.46%vs 1.09%）（P=0.051）等厭氧菌屬，HPV 陽(yáng)性組較HPV 陰性組占比增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 兩組樣本屬水平物種組成柱狀圖

2.3 陰道菌群結(jié)構(gòu)類型與陰道PH 和HPV 感染的關(guān)系

根據(jù)細(xì)菌16SrRNA 高通量測(cè)序的結(jié)果，將屬水平菌種占比＞50%者定義為優(yōu)勢(shì)菌，將陰道群落結(jié)構(gòu)分為3 種類型：Ⅰ乳酸桿菌優(yōu)勢(shì)型79 例（77.45%）；Ⅱ厭氧菌優(yōu)勢(shì)型17 例（16.67%），包括加德納菌優(yōu)勢(shì)11 例，雙歧桿菌2 例，鏈球菌1 例，志賀菌1 例，斯內(nèi)西亞菌1 例，shuttleworthia 1 例；Ⅲ無(wú)優(yōu)勢(shì)菌型6 例（5.88%），見(jiàn)表2。

表2 陰道菌群類型、pH與HPV感染的關(guān)系

陰道菌群結(jié)構(gòu)與陰道酸堿度：隨乳酸桿菌減少陰道pH升高，乳酸菌優(yōu)勢(shì)型與非乳酸菌優(yōu)勢(shì)型相比[10.13%（8/79）vs 60.87%（14/23）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.197，P＜0.001）。

陰道菌群結(jié)構(gòu)與HPV感染：乳酸菌優(yōu)勢(shì)型和非乳酸菌優(yōu)勢(shì)型HPV感染率相比[35.44%（28/79）vs 39.13%（9/23）]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.105，P=0.746）。

HPV 感染與陰道酸堿度：pH 升高者較pH 正常者HPV 感染率增加[50.00%（11/22）vs 32.50%（26/80）]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.286，P=0.131）。

3 討論

3.1 宮頸HR-HPV感染與陰道乳桿菌優(yōu)勢(shì)

陰道與體外相通，正常女性陰道內(nèi)有多種微生物存在。利用對(duì)細(xì)菌16SrRNA 高通量測(cè)序技術(shù)，2011 年Ravel 等[5]以占比50%以上的菌群為優(yōu)勢(shì)菌，首次將健康育齡婦女的陰道菌群分為5 種類型（community state types，CST）：CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ和CSTⅣ四型均以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，CSTⅣ型無(wú)優(yōu)勢(shì)菌。大多數(shù)人以少量乳桿菌為主，CSTⅣ型菌群結(jié)構(gòu)在少數(shù)健康女性中出現(xiàn)，種族地域存在差異[6]。成熟健康女性的陰道環(huán)境因性激素周期變化、月經(jīng)血沖刷和性交等因素動(dòng)蕩復(fù)雜，乳酸菌優(yōu)勢(shì)和CSTⅣ互相轉(zhuǎn)化，但往往恢復(fù)較快，并不出現(xiàn)微生物群落多樣性的增加和乳酸水平的下降[7-8]。近期報(bào)道的一項(xiàng)跨度長(zhǎng)達(dá)24 年的前瞻性研究，對(duì)比分析宮頸HPV16 獲得、持續(xù)、清除不同狀態(tài)陰道菌群變化發(fā)現(xiàn)，是否感染HPV16 陰道菌群多樣性并無(wú)差異，如果陰道環(huán)境長(zhǎng)期不穩(wěn)定，更多停留在CSTⅣ，則易發(fā)展為HPV 持續(xù)感染[9]。也有研究認(rèn)為宮頸HPV 感染與陰道乳桿菌減少，菌群豐度和多樣性增加顯著相關(guān)[10-11]。本研究中HPV陽(yáng)性和HPV陰性均以乳酸桿菌占主導(dǎo)地位，菌群豐度和多樣性相似，陰道是否乳酸菌優(yōu)勢(shì)對(duì)HPV感染無(wú)明顯影響。

3.2 宮頸HR-HPV感染與陰道厭氧菌過(guò)度生長(zhǎng)

厭氧菌致病機(jī)制：①對(duì)宮頸陰道黏膜屏障的影響和破壞，使病毒粒子易于通過(guò)[12]；②釋放細(xì)胞毒物質(zhì)（酶和代謝物），分泌炎性細(xì)胞因子，產(chǎn)生顯著的細(xì)胞病變效應(yīng)。CSTⅣ菌群結(jié)構(gòu)與BV 相似，都以厭氧菌過(guò)度生長(zhǎng)，多菌性生態(tài)失調(diào)為特征。文獻(xiàn)報(bào)道患有CSTⅣ樣病癥的女性陰道液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6（interleukin-6,IL-6）、γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、IL-1β、IL-4、IL-12p70、IL-10 和IL-8 升高[13]，這些促炎狀態(tài)導(dǎo)致組織損傷，可能增強(qiáng)人乳頭狀瘤病毒的致癌潛力。研究證實(shí)這種菌群結(jié)構(gòu)清除HPV的能力最差，HPV 陽(yáng)性樣本比例最大，而且隨CIN 進(jìn)展，CSTⅣ型比例增加[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)宮頸HR-HPV 感染婦女的陰道微生物群的特征是大量的細(xì)菌性陰道病相關(guān)細(xì)菌(bacterial vaginosis-associated bacteria, BVAB)，具有非乳桿菌占優(yōu)勢(shì)的陰道微生物群的婦女感染HR-HPV 的人數(shù)成倍增加[15]。本研究中，HPV 陽(yáng)性組較HPV 陰性組加德納菌、小球藻、斯內(nèi)西亞菌、奇異菌等厭氧菌屬占比明顯增多（18.89%vs 11.02%），還發(fā)現(xiàn)厭氧菌優(yōu)勢(shì)較乳酸菌優(yōu)勢(shì)并未增加HPV 感染（29.41% vs 35.44%），無(wú)優(yōu)勢(shì)菌型HPV 感染成倍增加（66.67%），雖結(jié)果一致，但樣本量不足。鑒于宮頸HPV 感染絕大多數(shù)可以自然清除，故一般認(rèn)為陰道菌群失調(diào)不是HPV 感染的必要條件，主要是影響HPV的清除能力。

3.3 陰道酸化殺菌與HPV感染、陰道菌群

一般陰道pH 值均以非乳桿菌屬的比例增加而增加，將育齡婦女陰道大量乳酸桿菌的出現(xiàn)和pH＜4.5 定義為“健康”，但并非絕對(duì)。pH 值升高也出現(xiàn)在一些具有高比例乳桿菌屬的群落中[7]。體內(nèi)研究說(shuō)明，由乳酸菌主導(dǎo)的陰道液pH＜4，有顯著的殺滅病原體作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌優(yōu)勢(shì)與陰道酸堿度顯著相關(guān)（P＜0.01），無(wú)優(yōu)勢(shì)菌型全部pH 升高，推測(cè)陰道pH升高出現(xiàn)在多菌性菌群失調(diào)之前，乳酸桿菌減少，陰道酸化殺菌能力下降可能是導(dǎo)致陰道菌群失調(diào)的原因。病毒轉(zhuǎn)化的人乳頭瘤病毒E5 蛋白對(duì)低酸堿度特別敏感[17]，陰道酸堿度的升高有利于HPV 的復(fù)制。在一項(xiàng)對(duì)9 165 名哥斯達(dá)黎加?jì)D女的研究中，顯示陰道酸堿度＞5 與絕經(jīng)前婦女宮頸HR-HPV 陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)增加10%～20%顯著相關(guān)[18]。本研究中，陰道pH升高者和pH正常者相比，宮頸HRHPV 感染率由32.50% 上升到50.00%，增加了17.5%。

綜上所述，若導(dǎo)致陰道酸堿度升高的因素長(zhǎng)期存在，或陰道酸化殺菌功能長(zhǎng)期喪失，則可能出現(xiàn)多菌性陰道菌群失調(diào)和宮頸HR-HPV 持續(xù)感染。降低陰道酸堿度可能是一種直接有效的清除HPV 感染的方法，但相關(guān)研究報(bào)道極少，需要嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的研究設(shè)計(jì)，進(jìn)一步進(jìn)行大樣本前瞻性研究。