賈學敏，羅忠福，李毅，湯磊,2，楊元勇*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

血栓可引起動脈粥樣硬化、冠心病以及缺血性腦卒中等心腦血管疾病，嚴重危害著人類健康[1-2]。血小板是血液中的重要組成成分，不僅在生理性止血中發(fā)揮重要作用，而且在動脈粥樣硬化斑塊破裂、血管內(nèi)皮細胞損傷或外源性物質(zhì)(如心臟內(nèi)支架或手術(shù)過程中的異物)刺激時，都會由靜息轉(zhuǎn)為活化，再通過粘附、聚集形成血栓[3]。因此，通過抗血小板聚集能夠有效預防和治療血栓。川芎嗪的化學名稱為2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine,TMP)，是從傳統(tǒng)中草藥川芎中提取分離得到的有效活性單體，具有抗血小板聚集、抗阿爾茨海默病及抗缺血再灌注損傷等作用[4-6]，已被開發(fā)應用于臨床，如TMP注射液、丹參TMP注射液等[7-8]。有研究表明，由于TMP具有藥代動力學不佳、半衰期短、代謝較快及藥理活性不強等缺點，研究者對其進行了結(jié)構(gòu)改造，以期發(fā)現(xiàn)活性更好的TMP衍生物[9-16]。研究表明，6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮類化合物在體外具有強效的抗血小板作用，如CI-914、CI-930等，通過對6-苯-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮化合物構(gòu)效關(guān)系分析不難發(fā)現(xiàn)，該類小分子的藥效基團為6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，同時苯環(huán)上對位取代活性最好，但是這些化合物在體內(nèi)的活性較弱，選擇性較差，限制了其應用[17-18]。因此，豐富該類化合物的結(jié)構(gòu)類型，尋找活性更佳、選擇性更好及副作用更低的抗血小板聚集化合物具有重要意義。本研究根據(jù)藥物化學中經(jīng)典的藥效團拼合原理以及生物電子等排原理，將TMP與6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮進行耦聯(lián)，設計、合成3個TMP-噠嗪酮衍生物，并進行體外抗血小板聚集活性研究，以期獲得活性更佳、副作用更低的抗血小板聚集候選化合物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 雄性新西蘭兔6只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，年齡90～120 d，購自貴州醫(yī)科大學動物中心[合格證號SYXK(黔)2018-0001]，動物于室溫(23±3)℃、相對濕度60%～80%條件下飼養(yǎng)1周后實驗。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器 TMP和阿司匹林(aacetylsalicylic acid，ASA；上海皓鴻)，二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP；南京建成)，花生四烯酸(arachidonic acid,AA；北京索萊寶)，柱層析硅膠(青島海洋)，三甲基吡嗪、α-酮戊二酸、乙酰苯胺、丁二酸酐及3-(4-甲氧基苯甲酰基)丙酸(上海皓鴻)；98-Ⅱ-B磁力攪拌電熱套和冷凍機(長城科工)，EYELA N-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和SHE-Ⅲ循環(huán)真空水泵(上海亞榮)，Avance NEO-600或400型核磁共振光譜儀(瑞士Bruker)，UPLC-QTOF型高分辨質(zhì)譜分析儀(美國Waters)，半自動凝血分析儀(北京中勤世帝)。

1.2 合成方法

1.2.12-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪的合成 取TMP 5 g溶于20 mL四氯化碳，加入N-溴代琥珀酰亞胺(N-Bromosuccinimide,NBS)6.54 g，催化量的過氧化二苯甲酰(benzoyl peroxide,BPO)，回流反應12 h、抽濾、濾液減壓蒸除溶劑，硅膠層析柱分離純化(V石油醚∶V二氯甲烷=2∶1)，得黃色油狀物4.17 g，產(chǎn)率為53%，放置備用[19]。

1.2.24-(4-乙酰氨基苯基)-4-氧代丁酸(中間體2)的合成 取無水三氯化鋁27.37 g置于100 mL反應瓶，室溫滴加N,N-二甲基乙酰胺(N,N-Dimethylacetamide,DMF)4.4 mL、待反應，降至室溫時移入70 ℃油浴，滴加碾碎的乙酰苯胺2.70 g和丁二酸酐2.03 g的混合物，反應2 h，加冰水180 mL，抽濾不溶性雜質(zhì)，收集濾液加濃鹽酸12 mL，4 ℃放置過夜，抽濾，收集濾餅，無水乙醇重結(jié)晶，獲得淺黃色固體(中間體2)1.70 g，產(chǎn)率為36%。

1.2.34-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸(中間體3)的合成 取中間體2500 mg，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，110 ℃反應2 h，置于冰浴，無水碳酸鈉pH調(diào)節(jié)至4，米白色固體析出，抽濾收集濾餅，用蒸餾水反復沖洗濾餅，干燥，得米白色固體(中間體3)381 mg，產(chǎn)率為93%。

1.2.44-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸甲酯(中間體4)的合成 取中間體375 mg置于10 mL反應瓶，加甲醇2 mL、濃硫酸1滴，回流反應6 h，加飽和碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生后，使用乙酸乙酯萃取3次，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和石油醚進行重結(jié)晶，得淺黃色固體(中間體4)69 mg，產(chǎn)率為85%。

1.2.54-氧代-4-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}丁酸甲酯(中間體5)的合成 取中間體4208 mg、1.2.1項下黃色油狀物200 mg、K2CO3276 mg置于25 mL反應瓶中，加丙酮10 mL，氮氣環(huán)境下回流反應8 h，放冷，抽濾除去過量K2CO3，減壓蒸除溶劑，經(jīng)硅膠柱分離純化(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，得黃色固體(中間體5)209 mg，產(chǎn)率為61%。

1.2.66-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體5188 mg，溶于乙醇5 mL，加85%水合肼41 mg，回流反應5 h，放冷，抽濾，濾餅充分干燥，乙醇重結(jié)晶，得白色固體(目標化合物a)166 mg，產(chǎn)率為93%。

1.2.74-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸(中間體7)的合成 取3-(4-甲氧基苯甲?；?丙酸2 g置于50 mL反應瓶，加冰醋酸18 mL、40%氫溴酸溶液8 mL，130 ℃反應24 h，加適量水，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶，得灰色固體(中間體7)1.40 g，產(chǎn)率為75%。

1.2.84-(4-羥基基苯基)-4-氧代丁酸甲酯(中間體8)的合成 取中間體71.00 g，溶于甲醇20 mL，滴濃硫酸3滴，回流反應5 h，加飽和碳酸氫鈉至無氣泡產(chǎn)生，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶，得到白色固體(中間體8)0.92 g，產(chǎn)率為88%。

1.2.94-氧代-4-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]丁酸甲酯(中間體9)的合成 取中間體8486 mg、2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(1.2.1項下黃色油狀物)500 mg及K2CO3645 mg置于50 mL反應瓶，加丙酮25 mL，氮氣環(huán)境下回流反應5 h，放冷，抽濾除去不溶物，減壓蒸溶劑，經(jīng)硅膠柱純化(V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1)，得白色固體(中間體9)480 mg，產(chǎn)率為59.9%。

1.2.106-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體9191 mg，溶于乙醇10 mL，加85%水合肼48 mg，回流反應5 h，反應完成后，放冷，抽濾，濾餅充分干燥，使用乙醇進行重結(jié)晶，得白色固體(目標化合物b)178 mg，產(chǎn)率為94.7%。

1.2.114-氧代-4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)丁酸(中間體12)的合成 取三甲基吡嗪1 g，溶于乙腈50 mL，加過硫酸銨9 g和AgNO30.2 g，氮氣下加乙腈12 mL、水60 mL及α-酮戊二酸 3.6 g，65 ℃攪拌5 h，放冷，加水50 mL，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，層析柱純化后(V二氯甲烷∶V甲醇=20∶1)，得淡黃色固體(中間體12)1.6 g，產(chǎn)率為87.9%。

1.2.126-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的合成 取中間體12200 mg，溶于乙醇10 mL，加85%水合肼64 mg，回流反應4 h，放冷，抽濾收集濾餅，濾餅充分干燥，乙醇打漿，得白色固體(目標化合物c)180 mg，產(chǎn)率為91.7%。

1.2.13體外抗血小板聚集活性檢測 體外的抗血小板聚集活性評價采用born比濁法進行測試[20]。家兔心臟取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(V血液∶V抗凝劑=9∶1)，1 200 r/min離心15 min，取上清得富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)；剩余血漿3 000 r/min離心10 min，取上清得貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。采用半自動凝血分析儀進行測試，取PRP 189 μL于測試杯，分別加目標化合物或陽性藥ASA 1 μL于37 ℃下孵育3 min，使用10 μmol/L ADP 10 μL或0.5 mmol/L AA 10 μL為誘導劑誘導PRP中血小板聚集，記錄5 min以內(nèi)的最大聚集率，重復7次取均值，根據(jù)公式計算出目標化合物的抗血小板聚集率(aggregation inhibition rate,AIR)[20]，并計算半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

2.1.1中間體2系4-(4-乙酰氨基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為202～204 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.11(s,1H)，10.27(s,1H)，7.94(d,J=8.8 Hz,2H)，7.72(d,J=8.7 Hz,2H)，3.21～3.16(m,2H),2.58～2.54(m,2H)，2.09(s,3H)；HRMS(ESI)C12H14N3O4[M-H]-的理論值和實際值分別為234.076 6和234.076 4。

2.1.2中間體3系4-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為180～182 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.03(s,1H)，7.69(d,J=8.7 Hz,2H)，6.57(d,J=8.7 Hz,2H)，6.03(s,2H)，3.06(t,J=6.4 Hz,2H)，2.51(t,J=4.3 Hz,2H)；HRMS(ESI)C10H10NO3[M-H]-的理論值和實際值分別為192.066 1和192.066 0。

2.1.3中間體4系4-(4-氨基苯基)-4-氧代丁酸甲酯，熔點為163～165 ℃；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ: 7.69(d,J=8.7 Hz,2H)，6.56(d,J=8.7 Hz,2H)，6.08(s,2H)，3.58(s,3H)，3.18～2.99(m,2H)，2.64～2.53(m,2H)；HRMS(ESI)C11H14NO3[M+H]+的理論值和實際分別為208.097 4和208.096 7。

2.1.4中間體5系4-氧代-4-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}丁酸甲酯，熔點為93～95 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.73(d,J=8.7 Hz,2H)，7.00(t,J=5.2 Hz,1H),6.73(d,J=8.8 Hz,2H)，4.40(d,J=5.2 Hz,2H)，3.57(s,3H)，3.12(t,J=6.3 Hz,2H)，2.58(t,J=6.3 Hz,2H)，2.47(s,3H)，2.44(s,3H)，2.42(s,3H)；HRMS(ESI)C19H24N3O3[M+H]+的理論值和實際值分別為342.181 8和342.181 9。

2.1.5目標化合物a系6-{4-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基甲基)氨基]苯基}-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮；熔點為199～200 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.65(s,1H)，7.51(d,J=8.8 Hz,2H)，6.72(d,J=8.8 Hz,2H)，6.46(s,1H)，4.35(s,2H)，2.83(t,J=8.2 Hz,2H)，2.48(s,3H)，2.45(s,3H)，2.42(s,3H)，2.39～2.34(m,2H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ: 167.43，150.33，150.00，149.68，148.67，148.06，147.84，127.27，123.95，112.31，46.37，26.70，22.09，21.50，20.65；HRMS(ESI)C18H22N5O[M+H]+的理論值和實際值分別為324.183 1和324.182 4。

2.1.6中間體7系4-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸，熔點為157～159 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.00(s,1H)，10.37(s,1H)，7.85(d,J=8.8 Hz,2H)，6.85(d,J=8.7 Hz,2H)，3.17～3.12(m,2H),2.56～2.51(m,2H)；HRMS(ESI)C10H9O4[M-H]-的理論值和實際值分別為193.050 1和193.050 5。

2.1.7中間體8系4-(4-羥基苯基)-4-氧代丁酸甲酯，熔點為169～170 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.36(s,1H)，7.85(d,J=8.8 Hz,2H)，6.85(d,J=8.7 Hz,2H)，3.58(s,3H)，3.25～3.13(m,2H)，2.67～2.56(m,2H)；HRMS(ESI)C11H13O4[M+H]+的理論值和實際值分別為209.081 4和209.081 3。

2.1.8中間體9系4-氧代-4-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]丁酸甲酯，熔點為104～106 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.96(d,J=8.9 Hz,2H)，7.14(d,J=8.9 Hz,2H)，5.26(s,2H)，3.59(s,3H)，3.27～3.22(m,2H)，2.65～2.61(m,2H)，2.49(s,3H)，2.45(s,3H)，2.44(s,3H)；HRMS(ESI)C19H23N2O4[M+H]+的理論值和實際值分別為343.165 8和343.165 9。

2.1.9目標化合物b系6-[4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基)苯基]-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，熔點為209～211 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 10.82(s,1H),7.69(d,J=8.8 Hz,2H)，7.07(d,J=8.9 Hz,2H)，5.19(s,2H)，2.90(t,J=8.2 Hz,2H)，2.48(s,3H)，2.45(s,3H)，2.44(s,3H)，2.41(t,J=8.2 Hz,2H)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ: 167.39，159.70，151.50，149.77，149.58，148.76，145.67，129.34，127.64，115.15，69.84，26.51，22.29，21.72，21.43，20.62；HRMS(ESI)C18H21N2O4[M+H]+的理論值和實際值分別為325.166 5和325.166 6。

2.1.10中間體12系4-氧代-4-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)丁酸，熔點為159～161 ℃；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.14(s,1H)，3.33(t,J=6.5 Hz,2H)，2.60(s,3H)，2.57(t,J=6.5 Hz,2H)，2.52(s,6H)；HRMS(ESI)C11H13N2O3[M-H]-的理論值和實際值分別為221.092 6和221.093 1。

2.1.11目標化合物c系6-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮，熔點為240～243 ℃；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ: 3.15～3.09(m,2H)，2.66(s,3H)，2.58～2.52(m,2H)，2.50(s,6H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ: 168.92，150.46，148.74，148.55，144.59，140.86，25.88，22.40，22.25，20.09，19.98；HRMS(ESI)C11H15N4O2[M+H]+的理論值和實際值分別為219.124 6和219.124 7。

2.2 抗血小板聚集活性

目標化合物a、b及c對ADP和AA所誘導的血小板聚集均有較好的抑制作用，其中化合物c的活性最佳，在ADP和AA誘導下的抗血小板聚集IC50分別為132.2 μmol/L和118.8 μmol/L，在2種誘導劑作用下，目標化合物的抗血小板聚集活性順序一致：c>a>b，優(yōu)于先導化合物TMP和臨床常用藥物ASA。見表1。

表1 化合物a、b及c的體外抗血小板聚集活性

3 討論

由于血小板不僅在血栓形成中扮演重要角色，在生理性止血中同樣具有重要作用，因此血小板作為血栓交聯(lián)的中心，常常成為抗血栓藥物的“明星靶點”。但遺憾的是目前臨床所應用的抗血小板聚集藥物或多或少的存在出血時間延長的副作用[21]。因此，如何平衡出血和凝血之間的平衡或?qū)ふ页鲅弊饔眯〉目寡“寰奂幬镆恢倍际茄芯康臒狳c，迫切需要發(fā)現(xiàn)新型的抗血小板聚集的化合物。

藥物化學中的藥效團拼合原理和生物電子等排原理是藥物開發(fā)的經(jīng)典策略之一，常?？傻玫剿幮f(xié)同或藥效增加的目標化合物[22-25]。TMP作為傳統(tǒng)中藥提取出的有效單體，以各種形式的制劑或復方應用于臨床，TMP具有一定的抗血小板聚集活性，但其活性較弱[19]；TMP的分子結(jié)構(gòu)簡單，可修飾空間較小，所以其結(jié)構(gòu)修飾多與其他活性小分子化合物進行耦聯(lián)[12-14]。小分子6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮已經(jīng)被證明具有較好的抗血小板聚集作用，但副作用較多[17]，同樣有待進一步研究。因此，本研究通過3條合成路線，以TMP為原料，經(jīng)溴代得到關(guān)鍵中間體2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪；然后以乙酰苯胺為原料，分別經(jīng)傅-克反應、脫乙?；?、與水合肼環(huán)合，最后與2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪發(fā)生取代反應得到目標化合物a；以3-(4-甲氧基苯甲?；?丙酸為原料，分別經(jīng)脫甲基、與水合肼環(huán)合，再與2-(溴甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪發(fā)生取代反應得目標化合物b；以三甲基吡嗪和α-酮戊二酸為原料，分別經(jīng)Minisci反應和水合肼環(huán)合得到目標化合物c。這3條路線合成路線中的原料廉價易得，合成過程中操作簡單方便，以高產(chǎn)率得到目標化合物a～c，目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)HRMS、1H NMR、13C NMR表征，且經(jīng)Scifinder檢索均為新化合物。

ADP和AA是血小板聚集的常用誘導劑，涉及到不同的機制通路，ASA通過抑制環(huán)氧化酶-1(cyclooxygenase-1,COX-1)使AA代謝為前列腺素G2受阻，使血栓烷A2(thromboxane,TXA2)的生成減少從而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用[26]。而血小板二磷酸腺苷受體亞基12(platelet adenosine diphosphate receptor subunit 12,P2Y12)是ADP的受體，ADP與P2Y12受體結(jié)合后，可使血小板激活，從而形成血栓[27]。因此，作用于這兩種通路的任一通路都可以影響血小板的聚集。Born比濁法廣泛用于抗血小板聚集活性研究，其原理是在正常情況下、低轉(zhuǎn)速下收集的富血小板血漿為米黃色的渾濁液體，加入誘導劑后，血漿中的血小板被激活，血小板發(fā)生聚集，血漿的透光度增加，通過透光度的變化反應血小板的聚集情況，該法具有操作簡便、重復性好等優(yōu)點[28-30]。因此，本研究以ADP和AA為誘導劑，采用Born比濁法進行目標化合物的抗血小板聚集活性測試，結(jié)果顯示，與ASA不同，化合物a～c不僅能夠發(fā)揮抗AA誘導的血小板聚集作用，對ADP誘導的血小板聚集同樣具有較好的抑制效果，提示該類化合物可以通過多重作用機制發(fā)揮抗血小板聚集活性。

綜上所述，在保留TMP活性母核的條件下，通過O、N橋與6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮進行耦聯(lián)，得到化合物a和b；另外，根據(jù)生物電子等排原理將6-苯基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮的苯基替換為TMP環(huán)，合成了化合物c，并對目標化合物進行體外的抗家兔的血小板聚集活性測試。如預期的那樣，目標化合物在AA和ADP誘導下的抗血小板聚集活性優(yōu)于先導化合物TMP和ASA，具有進一步研究的價值。此研究為后續(xù)抗血小板聚集化合物的研究提供了實驗依據(jù)和理論參考。