劉江華 臧博倫 劉煒 李彥格

神經(jīng)母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）起源于腎上腺髓質(zhì)或椎旁交感神經(jīng)節(jié)，發(fā)病率約為1.01/10萬，是兒童期最常見的顱外實體腫瘤，占相關(guān)兒童腫瘤死亡的15%[1]。NB起病隱匿，超過50%的患兒診斷時即為高危，其長期生存率不足50%[2]，因此探討影響高危NB療效的危險因素具有重要意義。配對同源異型盒蛋白2B（paired-like homebox 2B，PHOX2B）是一種在外周交感神經(jīng)系統(tǒng)中具有高度特異性的轉(zhuǎn)錄因子，最初在NB細胞株中被發(fā)現(xiàn)，研究表明PHOX2B參與了NB的發(fā)生發(fā)展[3]。雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（disialoganglioside，GD2）是NB細胞上廣泛表達的高度特異性抗原，可作為NB診斷的敏感特異標志物[4]。本研究通過檢測高危NB患兒骨髓中PHOX2B及GD2的表達，分析其與臨床指標及預(yù)后的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取我院2019年1月～2021年12月收治的新診高危NB患兒為研究對象。納入標準：符合NB診斷標準，危險度分組符合美國兒童腫瘤協(xié)作組（COG）高危標準[5]。排除標準：外院接受過治療者。共60例患兒納入本研究。收集患兒的臨床資料，包括初診年齡、性別、NSE、LDH、24h尿VMA、原發(fā)部位、轉(zhuǎn)移部位、骨髓轉(zhuǎn)移情況（常規(guī)骨髓涂片或流式細胞術(shù)檢測陽性）、MYCN基因、1p36缺失、11q23缺失、分期、危險度等。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準及患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 PHOX2B基因檢測 采用定量RT-PCR（qPCR）法檢測患兒骨髓中PHOX2B基因的表達水平。PHOX2B基因檢測試劑盒購自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，按試劑盒使用說明書進行操作及結(jié)果判定。PCR擴增條件：反應(yīng)體系為30μl，第一步：42℃，30min；94℃，5min。第二步：94℃，15s；60℃，1min，40個循環(huán)。在PCR循環(huán)第二步60℃時收集熒光信號。結(jié)果判定：將PHOX2B CT值≤34，21≤內(nèi)參CT值≤36判定為PHOX2B基因陽性。

1.2.2 GD2蛋白檢測 采用免疫細胞化學(xué)染色法檢測患兒骨髓標本中GD2蛋白表達水平。采集患兒EDTA～K2抗凝骨髓液3～5ml，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞層，通過制片機甩片獲得4～6張細胞涂片，每張玻片約含細胞5×105個，采用兩步法進行GD2染色[6]。陽性細胞判定及計數(shù)：抗GD2抗體結(jié)合位點主要在細胞膜上，故將圍繞細胞膜出現(xiàn)紅色顆粒樣沉淀（胞質(zhì)或可染色）判為陽性，對陽性細胞進行計數(shù)。

1.3 治療及療效評估 參照兒童NB診療專家共識進行治療和療效評估[5]。高?；純合然?約4個療程)后擇期手術(shù)，術(shù)后化療至VGPR后4個療程，總療程不超過8個，常規(guī)化療結(jié)束后行自體干細胞移植和瘤床放療?；熃Y(jié)束后口服13-順式-維甲酸維持治療6個月。

1.4 隨訪 通過門診、電話或再入院方式隨訪，隨訪終點截至發(fā)生事件的時間或末次隨訪時間。事件包括疾病進展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡，超過6個月未隨訪定義為失訪。隨訪時間截至2022年3月31日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（P25，P75）表示，計數(shù)資料用率（%）表示，樣本率的比較用卡方檢驗。生存率計算采用Kaplan Meier法，各組生存率比較應(yīng)用Log-Rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共60例高危NB患兒納入本研究，其中男32例，女28例，男女之比為1.14：1；中位年齡29個月（10～120個月），患兒的臨床特征見表1。

表1 60例高危NB患兒的臨床特征

續(xù)表1

2.2 PHOX2B、GD2與臨床指標的關(guān)系 PHOX2B基因陽性組原發(fā)部位為腹部者（33/38，86.8%）比例顯著高于PHOX2B基因陰性組（14/22，63.6%），PHOX2B基因陽性組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個（30/38，78.9%）患兒比例顯著高于PHOX2B基因陰性組（8/22，36.4%），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。GD2蛋白陽性組原發(fā)部位為腹部者（28/31，90.3%）比例顯著高于GD2蛋白陰性組（19/29，65.5%），GD2蛋白陽性組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個（24/31，77.4%）患兒比例顯著高于GD2蛋白陰性組（14/29，48.3%），GD2蛋白陽性組24h尿VMA升高患兒比例（15/31，48.4%）顯著高于GD2蛋白陰性組（6/29，20.7%），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PHOX2B基因陽性組與PHOX2B基因陰性組在年齡、性別、LDH、NSE、24h尿VMA、INSS分期、MYCN基因擴增方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。GD2陽性與陰性標本免疫細胞化學(xué)染色見圖1。GD2蛋白陽性組與GD2蛋白陰性組在年齡、性別、LDH、NSE、INSS分期、MYCN基因擴增方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1 GD2免疫細胞染色圖（×400）

表2 PHOX2B及GD2的表達與高危NB臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 PHOX2B及GD2與高危NB預(yù)后的關(guān)系PHOX2B基因陽性組2年無事件生存率（EFS）顯著低于基因陰性組（χ2=6.208，P=0.013），GD2蛋白陽性組2年EFS顯著低于蛋白陰性組（χ2=4.012，P=0.045），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。各組患兒的生存曲線見圖2。

圖2 不同組別患兒的生存曲線

3 討論

NB占嬰幼兒惡性腫瘤的8%～10%，具有很強的異質(zhì)性，可自行消退，也可迅速進展至多發(fā)轉(zhuǎn)移甚至死亡。目前經(jīng)過以危險度分層為依據(jù)的個體化治療，低危至中危NB患兒生存率可達85%，但高?；純杭词菇?jīng)過化療、手術(shù)、放療、自體造血干細胞移植、免疫治療等綜合治療，仍有60%的復(fù)發(fā)率[7]，復(fù)發(fā)后患兒的中位生存期僅為11個月[8]。骨髓微小殘留?。∕RD）的存在及初診時不精準的危險度分層是NB復(fù)發(fā)的重要原因，因此盡早發(fā)現(xiàn)骨髓MRD并依此調(diào)整危險度分層指導(dǎo)治療至關(guān)重要。

PHOX2B是一種特異表達于外周交感神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼基因位于染色體4p13，有研究表明，NB小鼠模型中PHOX2B的高表達能促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，這種作用是通過誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶及多巴胺羥化酶的表達調(diào)控原始神經(jīng)嵴細胞向成熟神經(jīng)細胞發(fā)育實現(xiàn)的[9]。PHOX2B在外周NB患者骨髓中高表達，在其它類型小圓藍細胞腫瘤及正常組織中無表達，可作為區(qū)分外周神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和中樞神經(jīng)胚胎性腫瘤的指標[10]。既往PHOX2B檢測多用于病理免疫組化中，體液標本中應(yīng)用qPCR方法檢測少見。本研究通過實時定量PCR法檢測骨髓中PHOX2B的表達，發(fā)現(xiàn)高危NB患者骨髓中PHOX2B陽性表達占63.3%，為研究PHOX2B在NB中的作用提供了不同的檢測方法，有望推廣應(yīng)用于臨床。另有研究表明[11]在高危NB中PHOX2B基因的陽性表達率高達80.8%，隨著原發(fā)瘤灶的減小，PHOX2B基因拷貝數(shù)也明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)PHOX2B基因陽性表達組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個者患兒比例顯著高于基因陰性組（χ2=10.880，P=0.001），EFS顯著低于基因陰性組（χ2=6.208，P=0.013），提示PHOX2B可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程并可作為評判預(yù)后的指標，與上述報道一致，有望作為NB轉(zhuǎn)移防治的靶點。

GD2主要在神經(jīng)外胚層腫瘤中表達，在NB細胞中100%高表達，正常組織中幾乎不表達，檢測骨髓GD2的表達對診斷NB骨髓轉(zhuǎn)移有較高的敏感性和特異性[12]。目前國際NB危險度分級協(xié)作組（International neuroblastoma risk group，INRG）推薦使用免疫細胞學(xué)檢測GD2抗原[13]。本研究利用免疫細胞化學(xué)法檢測高危NB患兒骨髓標本中GD2的表達，發(fā)現(xiàn)GD2陽性表達組較陰性組原發(fā)灶為腹部者多，可能與腹部起病隱匿，診斷時即發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者多、腹部NB發(fā)病率高、本研究其它部位NB病例數(shù)較少等因素有關(guān)，有待擴大樣本量進一步研究證實。另外，本研究發(fā)現(xiàn)GD2陽性表達組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個（χ2=5.480，P=0.019）、24h尿VMA升高（χ2=5.053，P=0.025）患兒比例顯著高于GD2蛋白陰性組，上述兩種指標反映了腫瘤的惡性程度及負荷，提示骨髓GD2的表達量可作為評估NB增殖和轉(zhuǎn)移的指標。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，GD2蛋白陽性組較陰性組有更低的EFS，提示骨髓GD2檢測可作為NB預(yù)后監(jiān)測的指標。

綜上，本研究檢測了高危NB患兒骨髓PHOX2B及GD2的表達，并分析其與NB臨床特征及療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PHOX2B及GD2陽性組較陰性組有更低的EFS，提示骨髓PHOX2B及GD2檢測有望作為高危NB微小殘留病監(jiān)測及預(yù)后評估的指標。本研究的局限性在于骨髓穿刺為有創(chuàng)操作，建議在初診、評估及考慮復(fù)發(fā)時使用，如腫瘤負荷較高，可嘗試采用外周血標本替代。