陳 曦,周明慧,張潔瓊,伍燕湘,田 巍,王松雪

(國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037)

準確提取樣品中的所有砷形態(tài)是進行形態(tài)分析的首要條件,目前常用的提取劑為硝酸、甲醇、三氟乙酸或蛋白質(zhì)提取液等[8-11]。提取方法主要包括烘箱熱浸提法、微波輔助萃取法和超聲提取法等[12-14]。本課題組前期研究結果顯示,采用稀硝酸溶液進行提取時,稻米中不同砷形態(tài)的提取率接近100%,相對于烘箱熱浸提法和超聲提取法,微波輔助萃取法具有提取效率高、有利于保護砷形態(tài)間不發(fā)生轉(zhuǎn)化及損失等優(yōu)點[15]。在此研究基礎上,本工作對前處理條件進行優(yōu)化,包括提取劑濃度、提取溫度和提取時間等,利用反相液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(RPLC-ICP-MS)對玉米中4種砷形態(tài){一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三價砷[As(Ⅲ)]和五價砷[As(Ⅴ)]}進行分離測定,通過優(yōu)化流動相,4種砷形態(tài)可在4 min內(nèi)完成測定,可為相關從業(yè)人員提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型液相色譜儀;8900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;Topex型微波消解儀;Milli-Q 型超純水處理系統(tǒng);3-30K 型高速離心機;FE28-Standard 型pH 計;Pulverisette 14型粉碎機。

As(Ⅲ)標準溶液:75.7μg·g-1(以砷計,下同),編號為GBW 08666;As(Ⅴ)標準溶液:17.5μg·g-1,編號為GBW 08667;MMA 標準溶液:25.1μg·g-1,編號為GBW 08668;DMA 標準溶液:52.9μg·g-1,編號為GBW 08669。

混合標準儲備溶液:以水為稀釋劑,將各砷形態(tài)標準溶液稀釋成100 mg·L-1混合標準儲備溶液。

混合標準溶液系列:用流動相作稀釋劑,將混合標準儲備溶液逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為2,5,10,20,25,50μg·L-1的混合標準溶液系列。

硝酸純度為BV-Ш 級(金屬雜質(zhì)總質(zhì)量分數(shù)不超過10-5%～10-3%);磷酸氫二銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、己烷磺酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉均為色譜純;試驗用水為超純水。

侵襲性肺真菌感染（IPFI）是指真菌直接侵犯（非寄生、過敏或毒素中毒）肺或支氣管引起的急、慢性組織病理損害所導致的疾病。IPFI發(fā)病率正逐年增加[1]。因其臨床表現(xiàn)不典型，影像表現(xiàn)多樣，常常被誤診誤治。目前肺活檢病理仍是診斷侵襲性肺真菌病的金標準。通過活檢取得病理學資料早期、正確的指導抗真菌治療將大大節(jié)約醫(yī)療衛(wèi)生成本，改善IPFI患者的預后。近年來，CT引導下肺穿刺活檢術不斷成熟，該技術的發(fā)展和應用彌補了電子支氣管鏡活檢的不足。本研究回顧性分析了我院2016年1月～2018年4月接受低劑量CT引導下經(jīng)皮同軸穿刺肺活檢技術的30例肺真菌病診斷病例，現(xiàn)總結報道如下。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 RPLC條件

Agilent ZORBAX SB-Aq 反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為5 mmol·L-1己烷磺酸鈉-20 mmol·L-1檸檬酸的混合溶液(pH 4.3);等度洗脫;流量1.0 mL·min-1;進樣量5μL。

1.2.2 ICP-MS條件

射頻功率1 550 W;載氣流量0.85 L·min-1;補償氣流量0.30 L·min-1;蠕動泵轉(zhuǎn)速0.5 r·min-1;采樣深度8 mm;氦氣碰撞反應池分析模式,氦氣流量4.5 mL·min-1。

1.3 試驗方法

玉米樣品經(jīng)高速粉碎機研磨后,過孔徑為0.45 mm 篩網(wǎng),保存于干燥器中。取0.5 g樣品,置于聚四氟乙烯消解罐中,加入0.15 mol·L-1硝酸溶液7 mL,按表1程序進行微波輔助萃取。待提取液冷卻至室溫,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液過0.22μm 有機濾膜,濾液供RPLC-ICP-MS分析。

表1 微波輔助萃取程序Tab.1 Microwave assisted extraction procedure

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

2.1.1 提取劑濃度

綜合考慮不同砷形態(tài)尤其是i As在提取液中的穩(wěn)定性、與色譜分離柱的適用性、對環(huán)境和人員友好性以及提取效率等因素,本試驗擬采用GB 5009.11-2014 中的稀硝酸溶液作稀釋劑。以GBW(E)100380 玉米粉標準物質(zhì)為待測對象,以0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑,以烘箱熱浸提法作為提取方法,比較了不同提取溫度和提取時間下玉米中4種砷形態(tài)的提取量,結果見圖1。

圖1 0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑時玉米中4種砷形態(tài)在不同條件下的提取量Fig.1 Extraction amount of the 4 arsenic species in corn under different conditions with 0.15 mol·L-1 nitric acid solution as extractant

由圖1可知,在不同砷形態(tài)中,As(Ⅲ)最不易提取,需要更高的提取溫度和更長的提取時間,而DMA、MMA 和As(Ⅴ)均可用0.15 mol·L-1硝酸溶液在25～90 ℃下加熱0.5～2.5 h提取完全。鑒于此,參考GB 5009.11-2014,將提取溫度設置為90 ℃,硝酸溶液的濃度提升至0.30 mol·L-1,并與0.15 mol·L-1時i As的提取結果進行比對,如圖2所示。

由圖2可知:以0.30 mol·L-1硝酸溶液提取As(Ⅲ)時,其完全提取時間(1.5 h)較0.15 mol·L-1時的(2.5 h)短,提取效率更高;以不同濃度硝酸溶液提取As(Ⅴ)時,其提取量隨提取時間的延長均沒有顯著變化。綜合圖1結果可知,As(Ⅴ)易被提取,且對提取劑濃度、提取時間及溫度沒有依賴性。高濃度硝酸溶液對色譜柱的柱效影響較為顯著,因此試驗選擇以0.15 mol·L-1硝酸溶液作為玉米樣品中不同砷形態(tài)的提取劑。

圖2 不同濃度硝酸溶液下玉米中iAs的提取量Fig.2 Extraction amount of iAs in corn under different concentrations of nitric acid solution

2.1.2 微波輔助萃取條件

鑒于微波輔助萃取法提取時間更短,同時也是國際上廣泛采用的檢測iAs的前處理方法,因此試驗也以此方法處理玉米。以0.15 mol·L-1硝酸溶液作提取劑,試驗先參考文獻[15],以稻米的微波輔助萃取程序(表2)處理GBW(E)100380玉米粉標準物質(zhì)。

表2 微波輔助萃取程序[15]Tab.2 Microwave assisted extraction procedure[15]

結果顯示,MMA、DMA、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取量為0.003,0.009,0.062,0.151 mg·kg-1,總砷值為0.225 mg·kg-1,顯著低于標準物質(zhì)的認定值[(0.277±0.023)mg·kg-1],說明以稻米的萃取程序提取時,玉米樣品中各砷形態(tài)提取不完全,這可能與As(Ⅲ)未被完全提取有關。結合文獻研究可知,As(Ⅲ)易與蛋白質(zhì)和淀粉結合[16],而玉米中的蛋白質(zhì)含量普遍高于大米[17-18]。鑒于高溫可破壞蛋白質(zhì)的空間結構,使As(Ⅲ)完全釋放,試驗嘗試適當提高提取溫度和延長提取時間,優(yōu)化得到的微波輔助萃取程序見表1。以此條件處理GBW(E)100380玉米粉標準物質(zhì),MMA、DMA、As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取量為0.004,0.011,0.096,0.150 mg·kg-1,總砷值為0.261 mg·kg-1,在標準物質(zhì)認定值的不確定度范圍內(nèi)。因此,試驗選擇以表1的微波輔助萃取程序提取玉米樣品中的4種砷形態(tài)。

2.2 色譜條件的選擇

目前,糧食行業(yè)主要采用Hamilton 陰離子交換柱作固定相,采用15 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液或磷酸氫二銨溶液等單一磷酸鹽溶液作流動相進行色譜分離,而以此條件分析10μg·L-1混合標準溶液時,所需分離時間近10 min,如圖3(a)所示。為節(jié)省分析時間,試驗曾參考儀器生產(chǎn)商建議的12 mmol·L-1磷酸氫二鈉-44 mmol·L-1磷酸二氫鉀混合溶液作流動相,所得10μg·L-1混合標準溶液的色譜圖如圖3(b)所示,此時4種砷形態(tài)的分離時間可縮短至約8 min,但該流動相對As(Ⅲ)的洗脫能力明顯弱于單一磷酸鹽溶液的,且其鹽含量較大,對色譜柱的柱效以及儀器管路的清潔均有不利影響,故不予考慮。

圖3 分別采用單一和混合磷酸鹽溶液作流動相時混合標準溶液的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solution with single and mixed phosphate solutions as mobile phase

GB 5009.11-2014中第二篇第二法給出的流動相為10 mmol·L-1無水乙酸鈉、3 mmol·L-1硝酸鉀、10 mmol·L-1磷酸二氫鈉和0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉的混合溶液(pH 10),試驗以此流動相分離玉米中的砷形態(tài),并通過以下質(zhì)控方法對該流動相的長期使用效果進行考察。即開始時每測5個樣品分析1次混合標準溶液,在分析10個樣品后,每測10個樣品分析1次混合標準溶液,分析60個樣品后,所得各砷形態(tài)信號強度占第1次分析時信號強度的比值(信號響應率)見圖4。

圖4 玉米中4種砷形態(tài)信號響應率隨樣品數(shù)量的變化曲線Fig.4 Variation curves of signal response rate of the 4 arsenic species in corn with sample number

由圖4可知,信號響應率隨樣品數(shù)量的增加不斷下降,在分析60個樣品后,混合標準溶液中各砷形態(tài)的信號響應率僅約60%,這是由于流動相中鈉鹽和鉀鹽會沉積在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的關鍵配件,如樣品截取錐和采樣錐上,導致儀器的檢測靈敏度下降,方法的精確度變低。

為解決以上問題,本課題組經(jīng)過充分的文獻調(diào)研,以 Agilent ZORBAX SB-Aq 反相色譜柱(250 mm×4.6mm,5μm)作固定相,以5 mmol·L-1己烷磺酸鈉-20 mmol·L-1檸檬酸的混合溶液(pH 4.3)為流動相,以1.0 mL·min-1流量進行等度洗脫。在此條件下,10μg·L-1混合標準溶液的色譜圖見圖5。

圖5 優(yōu)化的色譜條件下混合標準溶液的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the mixed standard solution under optimized chromatographic conditions

結果表明:4種砷形態(tài)可在4 min內(nèi)實現(xiàn)完全分離,出峰時間僅為國家標準方法[19]的1/2,極大地提高了檢測效率;As(Ⅴ)、MMA 和DMA 的信號強度明顯高于以單一和混合磷酸鹽溶液為流動相時的,且流動相僅會引入少量鈉鹽,可保持樣品進樣系統(tǒng)的潔凈度,維持測定結果的穩(wěn)定;Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱價格低廉,對酸溶液具有較好的適用性。綜上,可采用上述流動相分析實際樣品中的4種砷形態(tài)。

2.3 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以4種砷形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應的信號強度為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,4種砷形態(tài)標準曲線的線性范圍均為2～50μg·L-1,線性回歸方程和相關系數(shù)見表3。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結果見表3。

表3 線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

由表3可知,4種砷形態(tài)標準曲線的線性關系較好,檢出限為0.041～0.054μg·L-1。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白玉米樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平進行6次平行測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

由表4可知,4種砷形態(tài)的回收率為94.2%～102%,測定值的RSD 小于3.0%,方法準確度和精密度均符合檢測要求。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

按照試驗方法分析天然污染玉米樣品,并將總砷值與標準方法GB 5009.11-2014的進行比對,結果見表5。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of the samples mg·kg-1

結果顯示:天然污染玉米樣品中不同砷形態(tài)的含量差異較大,iAs含量占總砷值的比例較高,有機砷的含量極低;所測樣品中總砷值與標準方法中所得的總砷值基本一致,進一步證實了本方法的準確度。

本工作通過優(yōu)化提取劑濃度、微波輔助萃取溫度和時間、色譜條件等,以RPLC-ICP-MS測定玉米中4種砷形態(tài)的含量,提高了玉米中不同砷形態(tài)的檢測效率和精確度。方法的檢出限、回收率和精密度均滿足行業(yè)檢測需求,通過對實際污染樣品的測定,進一步驗證了方法的準確度和適用性,可為玉米中不同砷形態(tài)的高通量快速測定提供有價值的參考依據(jù)。