梁莎莎，龐春英，鄧廷賢，陸杏蓉，段安琴，馬小婭，梁賢威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（廣西）水牛遺傳繁育重點(diǎn)實驗室，南寧 530001）

水牛奶乳汁濃厚，營養(yǎng)豐富，具有較高的乳脂肪（8.0%）、乳蛋白（4.5%）和不飽和脂肪酸比例，以及較低水平的磷脂和膽固醇[1]，有“奶中之王”之稱。牛奶脂肪主要由甘油三酯（超過95%）組成，其脂肪酸（FA）可源于瘤胃發(fā)酵的碳水化合物，或通過脂蛋白脂肪酶的作用直接來源于血漿[2]。脂蛋白分解酶（lipoprotein lipase，LPL），全稱為三脂酰甘油蛋白脂?；饷福址Q為脂蛋白脂肪酶或脂蛋白酯酶[3]，于20世紀(jì)40年代被Hahn等[4]在開展犬體內(nèi)脂肪吸收實驗中發(fā)現(xiàn)，是由機(jī)體肝外組織的心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨骼細(xì)胞以及乳腺細(xì)胞等實質(zhì)性細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白[5]。脂蛋白脂肪酶（LPL）是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，在脂肪組織和牛奶的脂肪組成中發(fā)揮著重要作用[5]。LPL還能在細(xì)胞表面受體與脂蛋白間起到一種橋梁作用，因為它能同時結(jié)合細(xì)胞表面的特異性蛋白與脂蛋白，這將有利于細(xì)胞對脂蛋白的吸收[6]。LPL基因在動物的多個組織和器官中均有表達(dá)，廣泛分布于心臟、骨骼、脂肪以及泌乳期乳腺等組織中[7,8]。Casciano等[9]發(fā)現(xiàn)LPL有助于在表達(dá)MYC致癌水平的人類乳腺上皮細(xì)胞中促進(jìn)脂肪酸氧化。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)LPL具有較強(qiáng)的細(xì)胞攝取能力、較強(qiáng)的細(xì)胞活力抑制作用、較強(qiáng)的抗腫瘤作用和明顯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力，可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的潛在應(yīng)用。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)LPL的表達(dá)量與單不飽和脂肪酸具有正相關(guān)性，而與飽和脂肪酸具有負(fù)相關(guān)性。Zhao等[12]發(fā)現(xiàn)與干奶期相比，山羊的LPL mRNA表達(dá)量在泌乳初期顯著增加。大量研究表明，LPL基因?qū)Σ溉閯游锏娜榉肯嚓P(guān)疾病、泌乳性能等方面起重要作用。然而目前關(guān)于水牛LPL基因的研究較少，本文通過對水牛LPL基因編碼序列進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并檢測該基因在水牛不同組織和不同泌乳時期乳腺組織中的轉(zhuǎn)錄水平，以期為今后深入挖掘水牛LPL基因功能提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗組織樣品

試驗水牛乳腺及其他組織cDNA來自廣西水牛研究所。不同組織表達(dá)分析使用的樣本品種為尼里水牛，月齡約為48個月，其中泌乳時期的3頭；不同泌乳時期表達(dá)分析使用的乳腺組織樣本，品種為摩拉水牛，月齡約為72個月，泌乳時期分別為產(chǎn)犢后第7天（D7）、50天（D50）、140天（D140）和280天（D280），每個泌乳時期各3頭。所有樣本均保存于-80℃。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；PowerUp SYBR Green Master Mix購自Life公司；pMD18-T載體、Premix Taq酶均購自TaKaRa公司。

1.3 主要儀器

NanoDrop2000紫外分光光度計（Gene，USA），Biometra Tprofessional多功能快速梯度PCR儀（Biometra，GRE）和Roche Lightcycler 480實時熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1 水牛LPL基因克隆及引物設(shè)計

使用NanoDrop 2000紫外分光光度計和1.0%的瓊脂糖凝膠對cDNA樣本進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控后的基因組cDNA樣本稀釋至30～40ng/μL。以GenBank中黃牛LPL基因序列（GenBank登錄號：NM_001075120.1）為模板，使用Primer3.0在線軟件設(shè)計引物，克隆引物序列為F：5’-ATGGAGAGCAAGGCCCTACTTC-3’，R:5’-TCAGCCAGACTTTCTATTCAGGG-3’；qPCR引物序列為F:5’-GACACTTGCCACCTCATTCC-3’，R:5’-GTCCGGTTCCCTCTTGTACA-3’，均由華大基因合成。

2.2 PCR擴(kuò)增與克隆測序

PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板1μL，Premix Taq 25μL，上、下游引物各2μL，ddH2O 20μL；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃延伸8min。取50μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的片段進(jìn)行膠回收，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接6h后，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選挑菌培養(yǎng)后，委托華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)比對拼接后，獲得水牛LPL完整CDS序列。

2.3 水牛LPL基因的組織表達(dá)分析

將水牛的乳腺、心、輸卵管、肺、脾、腎、卵巢、大腸、淋巴、子宮、胃、肝、大腦和垂體共14種組織的cDNA稀釋至30～40ng/μL，使用實時熒光定量PCR檢測LPL以及GAPDH的基因的表達(dá)。反應(yīng)體系（20μL）：PowerUp SYBR Green Master Mix 10μL，Rnase water 8μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA 1μL；反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。

2.4 水牛LPL基因的不同泌乳時期乳腺表達(dá)分析

將水牛不同泌乳時期乳腺組織的cDNA稀釋至30～40ng/μL，使用實時熒光定量PCR檢測LPL以及GAPDH的基因的表達(dá)。反應(yīng)體系（20μL）：PowerUp SYBR Green Master Mix 10μL，Rnase water 8μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 1μL；反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用PSORT Ⅱ Prediction在線網(wǎng)站（https://psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用SignalP 5.1在線軟件進(jìn)行信號肽分析；使用TMHMM在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用SPSS 16.0對組織和泌乳期乳腺表達(dá)結(jié)果作單因素方差分析并使用GraphPad Prism 7軟件作表達(dá)量對比圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 水牛LPL基因CDS序列的克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)了1個單一DNA條帶，片段大小為1 437bp，與預(yù)測的片段大小一致（圖1）。將擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物送公司測序拼接后，獲得了水牛LPL基因完整的CDS序列，該序列長為1 437bp，可編碼478個氨基酸殘基。

圖1 水牛LPL基因PCR產(chǎn)物1%凝膠電泳圖

3.2 水牛LPL亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用PSORT Ⅱ Prediction在線軟件預(yù)測水牛LPL亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：定位于細(xì)胞外（包括細(xì)胞壁）、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡的比例分別為55.6%、22.2%、11.1%和11.1%，說明水牛LPL主要分布于細(xì)胞外。

3.3 水牛LPL信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用SignalP 5.1和TMHMM在線軟件對水牛LPL蛋白進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析（圖2、圖3）。信號肽分析結(jié)果顯示，該蛋白的信號肽的切割位點(diǎn)位于SRGGL之間，概率為0.4029；跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白不存在跨膜域，故此蛋白不屬于跨膜蛋白，可能屬于分泌蛋白。

圖2 水牛LPL基因編碼蛋白信號肽預(yù)測

圖3 水牛LPL蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

3.4 水牛LPL基因的組織表達(dá)分析

使用SPSS 16.0對組織表達(dá)結(jié)果作單因素方差分析，選擇Duncan' s法進(jìn)行各組織間的多重比較，運(yùn)用GraphPad Prism 7軟件對qPCR結(jié)果作表達(dá)量對比圖。結(jié)果顯示，LPL在水牛乳腺、心和輸卵管組織的相對表達(dá)量極顯著高于其他組織器官（P＜0.01），其中在乳腺的相對表達(dá)量最高，其他組織的表達(dá)量從高到低依次為心、輸卵管、肺、脾、腎、卵巢、大腸、淋巴、子宮、胃、肝、大腦和垂體（圖4）。

圖4 LPL基因在不同組織中的表達(dá)

3.5 水牛LPL基因的不同泌乳時期表達(dá)分析

使用SPSS16.0對乳腺組織表達(dá)結(jié)果作單因素方差分析，選擇Duncan's法進(jìn)行各個泌乳時期的多重比較，運(yùn)用GraphPad Prism 7軟件對qPCR結(jié)果作表達(dá)量對比圖。結(jié)果顯示，LPL在水牛泌乳盛期和泌乳中期的乳腺組織中表達(dá)量極顯著高于泌乳早期和泌乳后期（P＜0.01），其中在泌乳盛期最高（圖5）。

圖5 LPL基因在不同泌乳期中乳腺組織的表達(dá)

4 討論

許多組織依賴血漿甘油三酯（TG）作為脂肪酸后續(xù)氧化或儲存的重要來源。血漿TG被包裝成富含TG的脂蛋白和極低密度脂蛋白（VLDL），它們分別來自飲食或在肝臟中合成的TG。血漿TG的利用依賴于脂蛋白脂酶（LPL），它附著在毛細(xì)血管內(nèi)皮上，催化TG的水解使其分裂為脂肪酸，因此LPL最初被稱為清除因子脂肪酶[13]。LPL調(diào)節(jié)循環(huán)TG的水解以及大多數(shù)組織（包括乳腺和脂肪組織）對脂肪酸的吸收，對乳汁中長鏈脂肪酸的攝取和分泌以及哺乳幼崽對高脂飼糧的吸收至關(guān)重要。LPL普遍缺失的小鼠在出生時的血漿TG水平明顯升高，并且由于無法處理乳汁脂質(zhì)而在24h內(nèi)死亡[14]。在哺乳期的雌性中，LPL的表達(dá)似乎受到調(diào)節(jié)，在脂肪組織中的表達(dá)水平顯著降低，而在乳 腺中的表達(dá)水平很高[15]。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，LPL基因在泌乳期水牛的乳腺組織中相對表達(dá)量極顯著高于其他組織器官（P＜0.01）。分泌性乳腺上皮細(xì)胞和位于乳房腺泡鄰近結(jié)締組織中的間質(zhì)細(xì)胞，都可能代表了脂質(zhì)耗盡的乳腺脂肪細(xì)胞的退化，都被認(rèn)為是哺乳期乳腺中LPL的來源[16]。LPL活性在泌乳乳腺中增加，獲取循環(huán)TG加入乳脂。在人類妊娠期間，乳汁合成速率非常慢，隨著乳脂合成的開始，產(chǎn)后乳汁中的LPL立即增加。隨著逐漸斷奶乳汁分泌的減少，乳汁中LPL活性顯著降低[17]。諸多因素影響水牛泌乳量及乳成分，其中泌乳期顯著影響水牛乳的干物質(zhì)、非脂乳固體、脂肪、蛋白、乳糖以及酪蛋白含量[18]。本試驗中泌乳期表達(dá)分析則發(fā)現(xiàn)，LPL在泌乳盛期的表達(dá)量極顯著高于其他泌乳時期（P＜0.01），結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于分泌蛋白且主要分布在細(xì)胞外，推測LPL可能在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)合成后分泌到細(xì)胞外，催化甘油三酯的水解，從而影響乳汁中的脂肪沉積，且在奶水牛泌乳盛期可能起重要作用。

5 結(jié)論

本試驗運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)與TA克隆技術(shù)成功克隆了水牛LPL基因的CDS序列，CDS序列長為1 437bp，編碼478個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白主要分布在細(xì)胞外，屬于分泌蛋白。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示LPL在水牛乳腺組織中的表達(dá)量最高。泌乳期表達(dá)分析結(jié)果顯示LPL在水牛泌乳盛期的乳腺組織中表達(dá)量最高。此次對水牛LPL基因的組織表達(dá)和泌乳期表達(dá)分析為日后進(jìn)一步探討水牛及其他物種LPL基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。