許瑞軒，張英俊，趙海明

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草地管理與合理利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所，衡水 053000）

隨著我國(guó)居民收入的增長(zhǎng)、食物消費(fèi)結(jié)構(gòu)的變化和畜禽水產(chǎn)品消費(fèi)的增加，畜牧養(yǎng)殖業(yè)對(duì)優(yōu)質(zhì)飼草料的需求不斷增加[1]。在“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”和“糧改飼”等政策的推動(dòng)下，紫花苜蓿、青貯玉米、飼用燕麥等優(yōu)質(zhì)飼草的種植越來(lái)越普及，尤其是在奶牛飼養(yǎng)中，紫花苜蓿和青貯玉米已經(jīng)成為日糧中不可或缺的飼草。飼草營(yíng)養(yǎng)成分分析和品質(zhì)檢測(cè)是飼草生產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖中的必要環(huán)節(jié)，近紅外光譜（NIR）技術(shù)因其分析速度快、樣品制備簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，越來(lái)越多地代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)方法，在生產(chǎn)實(shí)踐中大量應(yīng)用[2]。

在美國(guó)、加拿大、澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家，NIR技術(shù)在飼草品質(zhì)檢測(cè)的研究和應(yīng)用等方面已經(jīng)相對(duì)成熟，并廣泛商業(yè)化。我國(guó)的NIR發(fā)展相對(duì)較晚，國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者也積極開展了飼草飼料NIR檢測(cè)方法的研究，并成功建立了全株玉米青貯[3～6]、紫花苜蓿干草[7,8]、紫花苜蓿鮮草[2]、燕麥干草[9]等飼草的NIR模型，但我國(guó)的NIR模型大多并未應(yīng)用于商業(yè)，目前生產(chǎn)中應(yīng)用的近紅外模型也主要從美國(guó)引進(jìn)。NIR主要用于檢測(cè)飼草的干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、可溶性碳水化合物（WSC）等化學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分[9,10]，也可檢測(cè)青貯飼料的有機(jī)酸、pH等發(fā)酵指標(biāo)[6,11,12]及磷（P）、鈣（Ca）、鉀（K）等礦物質(zhì)元素[13]和纖維消化率[14]等。但目前在國(guó)內(nèi)的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中主要為單種飼草（干草或青貯）的NIR檢測(cè)，混合飼草的檢測(cè)模型還未見(jiàn)報(bào)道。

相比于單作飼草，豆科與禾本科飼草混播或間套作可以提高飼草的產(chǎn)量、品質(zhì)，以及水、肥、光、熱等資源利用效率，增加人工草地的穩(wěn)定性[15～17]?；谝陨蟽?yōu)勢(shì)，豆禾間混套越來(lái)越多地應(yīng)用到新建植或改良的人工草地中，進(jìn)而在生產(chǎn)中對(duì)豆禾混合飼草品質(zhì)快速檢測(cè)的需求也不斷增加。如苜蓿玉米套作系統(tǒng)，因其較高的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，成為我國(guó)一年兩熟地區(qū)極具有潛力的輪作系統(tǒng)[18]。但因缺乏相應(yīng)NIR模型，目前只能采用單種飼草的模型進(jìn)行檢測(cè)，其準(zhǔn)確性和可行性還有待驗(yàn)證。本研究采集了不同施肥水平和不同種植比例處理下的青貯玉米和紫花苜蓿套作系統(tǒng)的樣品并制作了混合青貯，利用當(dāng)前使用較為廣泛的玉米青貯商業(yè)模型之一進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的NIR分析，并與化學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，來(lái)驗(yàn)證用青貯玉米NIR模型檢測(cè)青貯玉米和紫花苜蓿混合青貯品質(zhì)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的采集與制備

本試驗(yàn)中用于制作青貯飼料的樣品，采自河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的青貯玉米和紫花苜蓿的套作試驗(yàn)田。試驗(yàn)中的紫花苜蓿品種為中苜1號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供，于2017年3月16日播種，播深2～3cm，播種量為22.5kg/hm2，東西行向，行距為20-40-20-40cm寬窄行；玉米品種為糧飼兼用品種鄭單958，購(gòu)自河南金博士種業(yè)股份有限公司，于2017年6月25日苜蓿刈割一茬后套播于苜蓿40cm行間。苜蓿玉米套作系統(tǒng)有兩個(gè)處理，分別為4個(gè)氮肥水平（0、60、120、180kg N/hm2）和3個(gè)玉米種植密度（30、45、60千株/hm2），以單作玉米作為對(duì)照（施氮量112kg N/hm2，玉米種植密度75千株/hm2），試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)區(qū)組。

2017年10月1～5日進(jìn)行苜蓿和玉米收獲和測(cè)產(chǎn)，留茬高度10cm，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取10株全株青貯玉米和1.0kg苜蓿，分別利用粉碎機(jī)粉碎至1～2cm后將同一處理組合的苜?；蚯噘A樣品充分混合，根據(jù)小區(qū)苜蓿和玉米的鮮重比，將兩種作物混勻并馬上取3.75kg混合物裝入5L的青貯桶（直徑17cm，高28cm，重約300g），單作玉米為100%玉米青貯，青貯密度為750kg/m3，密封，室溫放置（20～25℃）180d。青貯樣品共39個(gè)，其中包括3個(gè)100%玉米青貯和36個(gè)玉米苜?；旌锨噘A樣品。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

將開罐后混合均勻的青貯樣品置于65℃烘箱中烘48h，測(cè)定DM含量。將烘干的樣品粉碎過(guò)1mm篩。全氮（TN）含量使用元素分析儀（Elementar Analysensysteme GmbH, Germany）測(cè)定。粗蛋白含量為TN乘以6.25[19]。采用范式纖維分析法測(cè)定NDF和ADF含量[20]。采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定WSC含量[21]。

1.2.2 發(fā)酵品質(zhì)

青貯開罐后，稱取20g代表性樣品，加入180mL蒸餾水，使用家用榨汁機(jī)攪碎2min，再用4層紗布和定性濾紙過(guò)濾，得到浸出液，用pH計(jì)（PHS-3C, INESA,Shanghai, China）測(cè)定浸出液的pH值[22]。濾液進(jìn)一步用孔徑0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）（LC-20A；Shimadzu, Tokyo, Japan）測(cè)定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）。測(cè)定條件如下：色譜柱，Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C（8.0mm×30cm, Shimadzu）；柱溫，50℃；流動(dòng)相，3mmol/L HClO4；流速，1.0mL/min；進(jìn)樣量，5μL；檢測(cè)器，SPD-M20AVP（Shimadzu）[22]。氨態(tài)氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸比色法測(cè)定[23]。

1.2.3 近紅外檢測(cè)

將開罐后混合均勻的青貯樣品置于65℃烘箱中烘48h，粉碎并過(guò)1mm篩，進(jìn)行近紅外掃描，每個(gè)樣品做3次平行，取平均值。近紅外模型為美國(guó)引進(jìn)的全株玉米青貯模型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件中的一元線性回歸模型進(jìn)行分析，并檢驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性，比較青貯樣品化學(xué)分析值和NIR測(cè)定值之間的差異。如回歸模型的截距（a）和斜率（b）顯著（P＜0.05），則表明NIR檢測(cè)值與化學(xué)分析值有偏離[24]；回歸模型決定系數(shù)（r2）的大小也是表征兩者密切程度的指標(biāo)，r2越接近1.0，表明NIR檢測(cè)值與化學(xué)分析值之間的關(guān)系越緊密；采用均方根誤差（RMSE）評(píng)價(jià)回歸模型的偏差。此外，采用威爾莫特一致性指數(shù)（WIA, Willmott's Index of Agreement）來(lái)評(píng)價(jià)NIR檢測(cè)值與化學(xué)分析值之間的差異性[25]。當(dāng)WIA在0～1.0之間，WIA大于0.6時(shí)認(rèn)為模型有實(shí)際預(yù)測(cè)價(jià)值[26]。采用Sigmaplot 14.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)測(cè)定和近紅外預(yù)測(cè)結(jié)果

本研究中共有36個(gè)樣品為采集于苜蓿玉米套作田中并按照實(shí)際鮮重比例制作的混合青貯，混貯中苜蓿的比例在3%～33%之間，苜蓿在混貯中的比例受到玉米種植密度和施氮的影響，玉米種植密度越大，施氮量越高，苜蓿的占比越低。本試驗(yàn)中還包括3個(gè)100%全株玉米青貯樣品。所有被測(cè)樣品的平均苜蓿占比為12%（表1）。

表1 青貯樣品的苜蓿占比及其品質(zhì)指標(biāo)的近紅外（NIR）預(yù)測(cè)和化學(xué)分析結(jié)果（n=39）

根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中常用的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和發(fā)酵指標(biāo)，對(duì)混貯和單貯樣品的DM、CP、NDF、ADF、WSC、pH、NH3-N、LA和BA含量，分別采用化學(xué)分析和近紅外模型進(jìn)行測(cè)定，所有指標(biāo)含量的分布范圍見(jiàn)表1。由表1可知，青貯樣品pH的平均值以及最大值、最小值在化學(xué)分析值與NIR預(yù)測(cè)值之間最接近，平均值僅相差0.8%。DM、CP和NDF等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的平均值相差在10%以內(nèi)，但NDF的化學(xué)分析最大值較NIR預(yù)測(cè)值高14.6%，ADF的化學(xué)分析平均值比NIR預(yù)測(cè)值高11.9%，最大值高18.6%，二者的最小值均較為接近，說(shuō)明NIR分析的NDF和ADF的范圍較化學(xué)分析大幅減小。同樣，WSC和乳酸的NIR預(yù)測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)差較化學(xué)分析值的標(biāo)準(zhǔn)差減小，說(shuō)明NIR預(yù)測(cè)值之間的差異很小，最大值和最小值的差異僅分別為0.8%和1.28%，而兩個(gè)指標(biāo)化學(xué)分析值的最大值和最小值之間的差異分別為4.35%和5.41%，二者的平均值的差異分別為27.1%和18.3%。NIR預(yù)測(cè)值與化學(xué)分析值之間差異最大的指標(biāo)為NH3-N和BA，平均值相差達(dá)83.6%和94.3%。

2.2 近紅外預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分析

表2為青貯樣品化學(xué)分析值與近紅外預(yù)測(cè)值之間的回歸關(guān)系，如結(jié)果所示，NDF和LA的斜率和截距均顯著，而DM、CP、ADF、WSC、pH、NH3-N等6個(gè)指標(biāo)在斜率和截距中僅有一個(gè)為顯著，說(shuō)明這些指標(biāo)的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值有偏離。對(duì)于回歸方程的決定系數(shù)，干物質(zhì)的r2最高，為0.85，其次為CP，其他所有指標(biāo)的決定系數(shù)均在0.5以下。威爾莫特一致性指數(shù)也是評(píng)價(jià)二者偏離程度的指標(biāo)，但只有DM和CP的WIA大于0.6，具有實(shí)際預(yù)測(cè)價(jià)值；而NDF、pH和LA的WIA均小于0.6，氨態(tài)氮和乙酸的WIA最小，僅為0.24，說(shuō)明該5個(gè)指標(biāo)的化學(xué)分析值與NIR預(yù)測(cè)值之間的差異較大，不具實(shí)際預(yù)測(cè)價(jià)值。

表2 青貯營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的化學(xué)分析值與近紅外預(yù)測(cè)值回歸關(guān)系（n=39）

根據(jù)各指標(biāo)化學(xué)分析值和NIR預(yù)測(cè)值之間的Pearson相關(guān)關(guān)系，只有圖1所示的四個(gè)指標(biāo)相關(guān)關(guān)系顯著，分別為干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維和乳酸含量，相關(guān)系數(shù)在0.393和0.928之間。NIR預(yù)測(cè)的CP普遍高于化學(xué)分析值，其他三個(gè)指標(biāo)的NIR預(yù)測(cè)值均低于化學(xué)分析值。

圖1 化學(xué)分析值和近紅外（NIR）預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系散點(diǎn)圖DM (a) CP (b) NDF (c) LA (d)

3.討論

近紅外模型的建立需要大量異質(zhì)性較高的樣品，尤其對(duì)于商用模型，需要定期加入新采集的樣品校正模型，因不同的品種、種植管理措施（如施肥、種植密度）和生長(zhǎng)環(huán)境（如積溫、光照）均對(duì)樣品的營(yíng)養(yǎng)成分累積有影響，所以使用變異范圍高的樣品以提高模型的準(zhǔn)確性和適用性。在模型的驗(yàn)證中，樣品的變異范圍也應(yīng)盡可能高，本研究采集的樣品來(lái)自不同的施肥梯度和種植密度處理，研究表明施氮可顯著增加玉米青貯的氨態(tài)氮、WSC和淀粉的含量[27]。此外，飼草的種類是影響NIR模型準(zhǔn)確性的另一個(gè)關(guān)鍵因素。如果飼草屬于同一科屬，因其結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)組分構(gòu)成相近，對(duì)近紅外光譜的特征吸收也相近，模型在一定程度上可以通用，如北美飼草與飼料近紅外聯(lián)盟（The NIRS Forage and Feed Consortium）就建立了禾草干草（grass hay）的模型，可用于絕大部分禾本科飼草營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè)；若為不同科的飼草，如豆科和禾本科，營(yíng)養(yǎng)成分差異較大，使用單種飼草的模型對(duì)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性有影響。研究表明[22]苜蓿玉米混貯相較全株玉米單貯的DM、CP、WSC、LA和NH3-N等的指標(biāo)有顯著差異。應(yīng)用單一飼草的NIR模型預(yù)測(cè)豆禾混合飼草的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)只能是退而求其次的方法，如本研究中在玉米青貯中加入了平均12%的苜蓿，苜蓿的占比較低，所以本研究采用了全株青貯玉米的模型來(lái)預(yù)測(cè)，若苜蓿的占比＞50%，則應(yīng)該使用苜蓿青貯的模型更為準(zhǔn)確。本研究結(jié)果也表明，用青貯玉米模型預(yù)測(cè)玉米苜?；熨A的化學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的效果較差，除DM和CP之外，其他指標(biāo)均無(wú)法達(dá)到可接受的預(yù)測(cè)精度。隨著豆禾混播和間套作的不斷普及，這類混合飼草的近紅外檢測(cè)需求將不斷增加，很有必要專門建立豆禾混合飼草干草和青貯的近紅外模型。

樣品的粒徑、狀態(tài)對(duì)近紅外光譜的采集和建模也有影響。不同于干草，青貯飼料是經(jīng)過(guò)發(fā)酵的新鮮樣品，會(huì)產(chǎn)生氨態(tài)氮、有機(jī)酸等發(fā)酵產(chǎn)物，所以青貯樣品的前處理方式對(duì)青貯品質(zhì)尤其是發(fā)酵品質(zhì)的預(yù)測(cè)有關(guān)鍵影響。目前在研究和實(shí)踐中用到的前處理方式主要有4種，分別為：新鮮樣品直接掃描、新鮮樣品凍干后粉碎過(guò)1mm篩、新鮮樣品65℃烘干后粉碎過(guò)1mm篩、掃描青貯樣品浸提液測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物及pH[6,11,12]。劉賢等[12]的研究表明不同樣品前處理方式之間青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)NIR模型的準(zhǔn)確性差異不大，但除pH之外，有機(jī)酸和氨態(tài)氮的相對(duì)分析誤差（RPD）均＜2.0，表明建模效果不佳；穆懷彬等[6]的研究也發(fā)現(xiàn)青貯玉米乳酸、乙酸和氨態(tài)氮的近紅外模型交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2）僅在0.37和0.59之間，對(duì)單指標(biāo)建模的效果不好，而對(duì)有機(jī)酸、氨態(tài)氮總分的建模效果較好。李宇萌等[28]在對(duì)玉米秸稈青貯飼料進(jìn)行NIR建模時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH、粗灰分、CP和DM的RPD均＞2.5，而WSC的RPD低于2.5，精度有待提高。在本研究中，新鮮青貯樣品取樣后經(jīng)過(guò)65℃烘干并粉碎，WSC、LA、BA、NH3-N等指標(biāo)的預(yù)測(cè)效果不佳，除了苜?；烊氲挠绊懼猓撃Ｐ瓦@些指標(biāo)的預(yù)測(cè)精度可能需要進(jìn)一步提高。

4.結(jié)論

本研究驗(yàn)證了使用玉米青貯近紅外模型預(yù)測(cè)青貯玉米和少量苜蓿混合青貯飼料品質(zhì)的可行性。結(jié)果表明，除DM和CP之外，其他化學(xué)營(yíng)養(yǎng)成分NDF、ADF、WSC和發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)均不適宜直接用青貯玉米的NIR模型預(yù)測(cè)。這提示一方面，亟需建立豆禾混合飼草的近紅外預(yù)測(cè)模型；另一方面，青貯飼料模型發(fā)酵指標(biāo)的預(yù)測(cè)精度需要進(jìn)一步提高。