薛東煒，李明山，劉嘉，祝興旺

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110032）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，占全身惡性腫瘤的2%～3%。自1975年以來，RCC的發(fā)病率以每年2%～4%的速度增長［1］。RCC的組織學(xué)亞型包括透明細(xì)胞RCC（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳頭狀RCC和嫌色RCC，其中ccRCC是腎癌的最常見亞型［2］，其進(jìn)展和預(yù)后受多種復(fù)雜基因的控制［3］。外科手術(shù)切除腫瘤是治療ccRCC的有效方法，盡管如此，仍有20%～38%的ccRCC患者術(shù)后發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［4］。因此，對ccRCC發(fā)生發(fā)展過程中基因表達(dá)變化的研究至關(guān)重要，有助于識別腎癌新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，提供新的治療靶點［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白（tumor necrosis factor-α-induced protein，TNFAIPs）家族參與了細(xì)胞凋亡和分化、信號傳導(dǎo)等多種生物學(xué)過程［6］，而TNFAIP2作為該家族中的重要一員，可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：正常腎小管上皮細(xì)胞系HK-2和人RCC細(xì)胞系786-O、ACHN（上海素爾生物科技有限公司）用含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）、10 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素（美國Invitrogen公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2 組織：正常腎臟組織和ccRCC組織（24對）來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析：應(yīng)用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（http：//timer.comp-genomics.org/）分析TNFAIP2在泛癌中的表達(dá)情況及其與免疫細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性［8］；應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)集（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中ccRCC組織的TNFAIP2mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫，對TNFAIP2mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，應(yīng)用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進(jìn)行ccRCC差異基因的富集分析。應(yīng)用Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier Plotter，http：//www.kmplot.com）數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站分析TNFAIP2表達(dá)與ccRCC數(shù)據(jù)庫中患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2.2 Western blotting：用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，裂解物上樣（40 μg/泳道）行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入1：2 000稀釋抗TNFAIP2抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）、抗 GAPDH 抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，加入二抗孵育90 min，TBST洗膜3次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光可視化系統(tǒng)（BeyoECL Plus，中國上海Beyotime 生物技術(shù)研究所）進(jìn)行檢測。

1.2.3 實時PCR檢測：用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）從組織中分離總RNA。按照The master mix reagent（美國Applied Biosystems公司）說明書行實時 PCR，反應(yīng)體系15 μL，包括TB Green 7.5 μL，ROX 0.3 μL，引物各0.3 μL，ddH2O 5.6 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個周期。TNFAIP2正向引物序列為5’-CCCCAATGACATCATCAACA-3’，反向引物序列為5’-GCCTCACTGGACAGGAATG T-3’［9］；GAPDH作內(nèi)參照，正向引物序列為5’-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列為5’-GAAG ATGGTGATGGGATTTC-3’。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0和Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。用 Pearson χ2檢驗分析TNFAIP2表達(dá)水平與ccRCC 的臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。用Kaplan-Meier曲線分析TNFAIP2表達(dá)水平與ccRCC患者預(yù)后之間的相關(guān)性。用TNFAIP2表達(dá)的受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估TNFAIP2對ccRCC的診斷效能，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNFAIP2在ccRCC中的表達(dá)

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TNFAIP2在ccRCC組織中異常高表達(dá)（P＜ 0.001），見圖1。ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ccRCCTNFAIP2表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平與正常組織比較有統(tǒng)計學(xué)差異［10-11］。TCGA、UALCAN、TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TNFAIP2在ccRCC中高表達(dá)，并與腫瘤的分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞Th1和Treg豐度密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），見圖2～3。KEGG通路的富集分析結(jié)果顯示，ccRCC參與包括TNF信號通路在內(nèi)的TOP20通路，見圖4。

圖1 TNFAIP2在泛癌中的表達(dá)情況Fig.1 TNFAIP2 expression in pan-cancer

圖2 TNFAIP2在ccRCC中的表達(dá)情況及其與分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系Fig.2 The expression of TNFAIP2 in ccRCC and its relationship with staging，grade，and lymphatic metastasis

圖3 腎癌中TNFAIP2的表達(dá)與免疫Th1細(xì)胞、Treg細(xì)胞的相關(guān)性Fig.3 Correlation between the expression of TNFAIP2 and immune Th1 cells and Treg cells in renal cell carcinoma

圖4 ccRCC差異免疫基因KEGG富集途徑分析Fig.4 KEGG enrichment pathway analysis of differential immune genes in ccRCC

2.2 TNFAIP2與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier曲線分析表明TNFAIP2表達(dá)水平與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，TNFAIP2mRNA高表達(dá)提示ccCRCC患者病情惡化及總生存期縮短（P＜ 0.001）；通過ROC曲線評估TNFAIP2mRNA表達(dá)對ccRCC的診斷效能，結(jié)果顯示，AUC=0.814，95%CI：0.796～0.887（P＜ 0.001），見圖5。

圖5 TNFAIP2與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系Fig.5 Relationship between TNFAIP2 and prognosis of ccRCC patients

2.3 TNFAIP2在腎癌細(xì)胞系和腎癌組織中的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，與人腎臟正常細(xì)胞系HK-2比較，腎癌786-O、ACHN細(xì)胞中TNFAIP2蛋白表達(dá)水平均明顯升高，見圖6。實時PCR檢測結(jié)果顯示，腎癌組織中TNFAIP2mRNA的表達(dá)量明顯高于對應(yīng)的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），見圖7。

圖6 TNFAIP2在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況Fig.6 The expression of TNFAIP2 in renal cancer cell lines

圖7 TNFAIP2 mRNA在腎癌組織和正常腎組織中的表達(dá)Fig.7 The expression of TNFAIP2 mRNA in kidney cancer tissues and normal kidney tissues

3 討論

ccCRCC被認(rèn)為是免疫浸潤性腫瘤，免疫治療具有革命性的前景［12］。但腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性促進(jìn)了治療抵抗，從而導(dǎo)致ccCRCC預(yù)后不良［13］。TNFAIPs包括TNFAIP1～TNFAIP8，均為促凋亡蛋白［14］，其中TNFAIP2 最初被認(rèn)為是人類內(nèi)皮細(xì)胞中的一種新的腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)基因，可能通過誘導(dǎo)TNFAIP2mRNA 表達(dá)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用［15］。王斌等［16］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TNFAIP2可通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移。但是TNFAIP2在ccRCC中的作用卻鮮為人知，因此，本研究基于公共數(shù)據(jù)庫分析TNFAIP2在ccCRCC中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的相關(guān)性，并通過體外實驗進(jìn)行驗證。

本研究中，利用公共數(shù)據(jù)庫TIMER2.0、TCGA、ONCOMINE和UALCAN進(jìn)行生物信息分析，發(fā)現(xiàn)TNFAIP2在ccRCC組織中異常高表達(dá)，且與腫瘤的分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜ 0.001），而TNFAIP2高表達(dá)亦能提示病情惡化及總生存期縮短，與其他研究［17］結(jié)果一致。

對人腎臟正常細(xì)胞系HK-2、腎癌細(xì)胞系786-O、ACHN中TNFAIP2表達(dá)水平的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腎癌細(xì)胞中TNFAIP2蛋白表達(dá)水平顯著增高，TNFAIP2mRNA在ccCRCC組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常腎臟組織。提示TNFAIP2可能參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。雖然化療、免疫治療及靶向治療是轉(zhuǎn)移性和進(jìn)展性腎癌重要的治療手段，而ccRCC對化療卻具有高度耐藥性［18-19］。文獻(xiàn)［20］報道，TNFAIP2高表達(dá)可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致尿路上皮癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP2表達(dá)與免疫細(xì)胞Th1和Treg豐度呈正相關(guān)，這為今后腎癌的免疫治療和化療提供了新的思路，未來有待進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，TNFAIP2在ccCRCC中的高表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)，因此，TNFAIP2有可能成為ccRCC早期診斷和預(yù)后評價的生物標(biāo)志物之一，可能為腎癌的靶向治療提供新的方向和策略。