馬小雯，楊巍，郝靚

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，沈陽 110122；2.遼寧省法醫(yī)學(xué)生物證據(jù)重點實驗室，沈陽 110122；3.中國醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，沈陽 110122；4.中國醫(yī)科大學(xué)臨床二系，沈陽 110122；5.遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團本鋼總醫(yī)院感染部，遼寧 本溪 117000）

乳腺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥。2020年公布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例［1］。乳腺癌的早期癥狀多不明顯，進展迅速，晚期可發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，直接威脅患者生命。浸潤型乳腺癌是乳腺腫瘤中高發(fā)的類型，其分化程度低，預(yù)后差，以浸潤性導(dǎo)管癌最為常見［2］。目前，雖然乳腺癌得到了廣泛研究，但發(fā)病機制仍不明確。

FAM110A定位于20號染色體的短臂。2007年，HAUGE在運用酵母雙雜交方法篩選參與細胞周期進程的中心體、微管相關(guān)蛋白的實驗中首次發(fā)現(xiàn)了FAM110家族蛋白。FAM110家族有3個成員定位于中心體，協(xié)助細胞周期的進展并參與微管的組織［3］。FAM110A的表達受到細胞周期的調(diào)控，與肝癌和前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［4-5］。目前FAM110A在乳腺癌中鮮有研究，其作用機制尚不明確。本研究利用多種數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，分析FAM110A在乳腺癌中的表達及對預(yù)后的影響，為進一步研究FAM110A在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制和治療提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

1.1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)提取和分析：在Oncomine數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）中根據(jù)本研究的需求設(shè)定篩選條件。（1）Gene：FAM110A；（2）Analysis type：cancer vs normal analysis；（3）Cancer type：breast cancer；（4）Data type：All；（5）P＜ 0.01，fold change ＞2，gene rank=top10%。

1.1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)提取及患者預(yù)后分析：利用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）對FAM110A的表達與分期和預(yù)后的關(guān)系進行預(yù)測。設(shè)置分期篩選條件為（1）Gene：FAM110A；（2）Datasets selection：BRCA；（3）Log Scale：yes。設(shè)置預(yù)后篩選條件為（1）Gene：FAM110A；（2）Methods：Overall Survival；（3）Group cutoff：median；（4）Hazards ratio：yes；（5）95% confidence interval：yes；（6）Axis units：months。

1.1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)提取和分析：利用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）補充驗證FAM110A在腫瘤不同分期、不同分子分型中的表達差異，并探究FAM110A表達與基因甲基化水平的關(guān)系。設(shè)置篩選條件為（1）Enter gene symbol：FAM110A；（2）TCGA dataset：Breast invasive carcinoma；（3）Links for analysis：Expression；（4）based on：individual cancer stages/major subclasses。

1.1.4 標本來源：利用人類蛋白圖譜（human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）獲取FAM110A在乳腺癌組織和正常組織中的免疫組織化學(xué)染色圖片。

1.1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/）預(yù)測FAM110A相互作用蛋白。

1.1.6 共表達基因聚類分析及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：從cBioPortal平臺（http：//www.cbioportal.org/）獲 取TCGA數(shù)據(jù)庫中FAM110A在乳腺癌中的共表達基因，然后運用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對相關(guān)度較高的基因進行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因和基因組（Kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG）富集分析。采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建共表達分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape中的Cytohubba插件計算共表達分子網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點連接度，選取連接度最高的10個節(jié)點。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗統(tǒng)計乳腺癌與正常組織之間FAM110A的表達差異。FAM110A不同病理分期間的表達差異比較采用單因素方差分析。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，組間生存率采用log-rank檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM110A在所有腫瘤中的表達

根據(jù)設(shè)置的篩選條件，Oncomine數(shù)據(jù)庫共有205項涉及FAM110A在不同腫瘤與正常組織比較的研究結(jié)果。其中10項研究有統(tǒng)計學(xué)意義。FAM110A在所有腫瘤中8項呈高表達，2項低表達。在乳腺癌中6項呈高表達。在GEPIA數(shù)據(jù)庫中FAM110A在11種腫瘤組織中呈顯著高表達。見圖1。

圖1 FAM110A在所有腫瘤中的表達Fig.1 Expression of FAM110A in all cancer types

2.2 FAM110A在乳腺癌中高表達

按照篩選條件檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示，乳腺癌組織與正常組織相比，其FAM110A表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2A。

檢索HPA數(shù)據(jù)庫，共得到3例FAM110A正常乳腺組織樣本中的免疫組織化學(xué)圖片，12例乳腺癌組織樣本中的免疫組織化學(xué)圖片（圖2B）。乳腺癌樣本中FAM110A呈高表達。在細胞內(nèi)，F(xiàn)AM110A高表達于G2、S期，表達水平與細胞周期密切相關(guān)（圖2C）。

圖2 FAM110A在乳腺癌中高表達Fig.2 FAM110A is highly expressed in breast cancer

2.3 FAM110A在不同分子分型乳腺癌中的表達情況

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫針對乳腺癌的分子分型進行在線分析。結(jié)果顯示，與正常組織相比，F(xiàn)AM110A在Luminal、HER（2+）、三陰性乳腺癌中的表達量均呈高表達（P均＜0.05）。且除去Luminal與HER（2+）之外，各個分型之間FAM110A表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖3 FAM110A在不同分型乳腺癌中表達水平Fig.3 Expression of FAM110A in different types of breast cancer

2.4 FAM110A的表達與預(yù)后的相關(guān)性

運用GEPIA分析FAM110A表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A高表達組總生存期（overall survival，OS）劣于低表達組（HR=1.4，P=0.043），見圖4A。在GEPIA數(shù)據(jù)庫中在線分析FAM110A表達與乳腺癌分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，不同分期之間FAM110A的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.84，P=0.023 3），見圖4B。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫在線分析得到相似結(jié)果。

圖4 FAM110A高表達提示不良預(yù)后Fig.4 High level of FAM110A expression is associated with poor prognosis

2.5 FAM110A共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能分析

運用STRING數(shù)據(jù)庫得到FAM110A蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，富集P值為0.028 9，與FAM110A存在相互作用的蛋白節(jié)點有10個，分別為FAM19A1、SMIM13、CSPP1、GPANK1、IL9、ANKRD9、ZDHHC18、TMEM132D、FAM135B和KCTD3（圖5）。檢索cBioportal數(shù)據(jù)庫，乳腺癌中FAM110A的共表達基因共有20 033個（P均＜0.05）。相關(guān)度最高的10個基因為MRPS26、PPDPF、SNRPB、NSFL1C、SLC2A4RG、SCAND1、ITPA、MRPL41、ARRDC1、RBCK1。GO富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A的共表達基因主要參與DNA模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控，線粒體平移延伸等生物途徑。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A的共表達基因主要參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解，癌癥的中心碳代謝等通路。

圖5 FAM110A共表達分子網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Co-expressed network of FAM110A

3 討論

乳腺癌是起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，發(fā)病率居全球女性惡性腫瘤的首位。其預(yù)后較好，患者生存率相對較高［6］。目前，乳腺癌主要根據(jù)臨床病理和分子分型進行治療，但三陰性乳腺癌和難治性多發(fā)耐藥乳腺癌仍缺乏有效的治療靶點［7］。因此，尋找乳腺癌的新治療靶點和預(yù)后標志物對于乳腺癌的臨床治療極為重要。

FAM110A是FAM110家族成員，作為中心體相關(guān)蛋白，參與細胞周期調(diào)控［3］。有研究［4］表明，F(xiàn)AM110A的高表達與肝癌的發(fā)生和較差預(yù)后相關(guān)，但其在乳腺癌中的研究較少。本研究利用多種數(shù)據(jù)庫分析FAM110A在乳腺癌中的表達水平及意義。

對Oncomine數(shù)據(jù)庫中16項對比FAM110A在乳腺癌和正常組織中表達差異的研究進行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A在乳腺腫瘤中呈高表達，可能誘導(dǎo)乳腺腫瘤的發(fā)生。FAM110A在不同分型乳腺癌中表達有統(tǒng)計學(xué)差異，可作為乳腺癌分型的標志物。分析HPA數(shù)據(jù)庫中FAM110A的免疫組化結(jié)果，乳腺癌中FAM110A的表達高，定位于核質(zhì)、胞質(zhì)及囊泡中，高表達于S期和G2期。這與HAUGE等［3］研究結(jié)果一致。

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A隨著乳腺癌分期的進展表達量顯著上升，高表達的患者預(yù)后更差。甲基化是DNA的一種表觀遺傳修飾，對基因表達有影響。乳腺癌組織中FAM110A基因甲基化水平顯著降低，提示甲基化修飾可能是上調(diào)FAM110A在乳腺癌中表達的重要因素。

STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A可能與ANKRD9、FAM135B、CSPP1等分子存在相互作用。ANKRD9是一種E3泛素連接酶，通過蛋白酶體途徑發(fā)揮抑癌作用［8］。FAM135B是一種細胞周期調(diào)控蛋白，可以正調(diào)控下游PI3K/Akt/mTOR通路［9］。有絲分裂相關(guān)蛋白CSPP1通過對于動點微管動態(tài)性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)染色體的運動，保證有絲分裂的準確性［10］。FAM110A可與上述蛋白互作影響腫瘤發(fā)生。隨后構(gòu)建乳腺癌中FAM110A的共表達基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過研究關(guān)鍵節(jié)點的功能推斷共表達基因網(wǎng)絡(luò)參與的重要生物學(xué)途徑。其中MRPL14作為連接度最高的節(jié)點，已被證實與乳腺癌相關(guān)［11-12］。

本研究對于FAM110A的共表達基因進行功能分析，探究其參與的生物途徑及通路。GO富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A的共表達基因主要參與DNA模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物途徑。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM110A的共表達基因主要參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解等通路。

綜上所述，F(xiàn)AM110A在乳腺癌中呈高表達，且在不同分型乳腺癌中有統(tǒng)計學(xué)差異。FAM110A的表達水平與患者預(yù)后呈負相關(guān)，與分期呈正相關(guān)，可作為新的乳腺癌預(yù)后標志物。目前對于FAM110A在乳腺癌中作用機制的研究仍較少。本研究初步預(yù)測了FAM110A參與的生物途徑及信號通路，為乳腺癌的診治及機制研究提供了思路。