魏攀鳳，鄒智勇，莊伊凡 (.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 泉州 36000；.廈門市思明區(qū)梧村街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心全科醫(yī)學(xué)，福建 廈門 36000；3.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院胃腸外科/廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院胃腸腫瘤研究所，福建 廈門 36000)

根據(jù)2020年全球癌癥報(bào)告，結(jié)直腸癌的新發(fā)病例和病死率均排在前5位[1]，晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率低于10%[2]。目前化療仍然是晚期結(jié)直腸癌最重要的輔助治療方法，然而固有或獲得性耐藥嚴(yán)重影響其治療效果[2-3]。隨著慢性病腸道起源學(xué)說(shuō)[4]研究的深入，證實(shí)多種化療[2,5]和免疫治療[6]方案的有效性均與體內(nèi)微生物組相關(guān)。

具核梭桿菌(fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)主要定植于口腔，是一種普遍存在的促炎自源性細(xì)菌，與食管癌、結(jié)直腸癌等的發(fā)生密切相關(guān)[7]。Zhang等[8]的研究顯示，唾液腺Fn基因可作為結(jié)直腸癌的潛在生物標(biāo)志物，且Fn基因表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的總生存期和無(wú)病生存期存在相關(guān)性。還有研究報(bào)道了Fn感染與結(jié)直腸癌[9]和食管鱗狀細(xì)胞癌[10]化療耐藥性的潛在關(guān)系，但Fn的具體誘導(dǎo)效應(yīng)和相關(guān)的分子機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬建立Fn與結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探討其在結(jié)直腸癌化療中誘導(dǎo)耐藥的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Fn標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25586(美國(guó)菌種保藏中心)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；腦心浸出液肉湯(BHI)細(xì)菌培養(yǎng)基(北京華越洋生物)、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU；美國(guó)Selleck Chemicals公司)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V/PI染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)；Pierce BCA Protein試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein,MRP1)、P糖蛋白(P-glycolprotein,P-gp)、Wnt2、β-catenin、β-actin多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)與分組

將HCT-116細(xì)胞水浴復(fù)蘇，在37 ℃、5% CO2、含10%胎牛血清的MyCoy’s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞配成5×106/mL的細(xì)胞懸液備用。將Fn凍干粉接種在BHI-s血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，重復(fù)洗滌，棄上清，用比濁法計(jì)算細(xì)菌濃度，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1×108/mL備用。參照Ma等[11]的方法，將Fn和HCT-116細(xì)胞按照病毒感染復(fù)數(shù)為100∶1的比例混合，于37 ℃、5% CO2中孵育12 h，制備細(xì)菌—細(xì)胞共培養(yǎng)(bacteria-cell co-culture,BCC)模型。

本研究設(shè)置4個(gè)組，將常規(guī)培養(yǎng)的HCT-116細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組；Fn與HCT-116細(xì)胞共培養(yǎng)設(shè)為BCC組；采用5-FU(1.5 μmol·L-1)分別干預(yù)生長(zhǎng)良好的對(duì)照組及BBC組細(xì)胞，并設(shè)為5-FU組和BCC+5-FU組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

收集各組細(xì)胞，按每孔200 μL的密度接種于96孔板，加入不同濃度5-FU(低濃度20 μmol·L-1、中濃度40 μmol·L-1、高濃度80 μmol·L-1)進(jìn)行干預(yù)，37 ℃、5%CO2孵育24 h。棄去原培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO水平振蕩溶解晶體，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度OD值(490 nm)，評(píng)估細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，按照2×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板孵育24 h。待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，加入60 μmol·L-15-FU繼續(xù)培養(yǎng)2周，每2天更換1次新鮮加藥培養(yǎng)基。終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗，細(xì)胞固定液室溫固定，Giemsa染液染色15 min，PBS清洗去浮色，空氣干燥，相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞集落形成情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好時(shí)加入60 μmol·L-15-FU，繼續(xù)培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)，胰酶消化，以2 000 r/min離心5 min，取上清，0.2 mL預(yù)冷的buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI染液混勻，室溫避光孵育10～15 min，于1 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀(Ex=488 nm；Em=530 nm)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞株，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，加入60 μmol·L-15-FU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入適量的PBS并用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，細(xì)胞懸液以10 000 r/min 4 ℃離心5 min后，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞獲得總蛋白，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組樣本50 μg上樣，恒壓(90 V、20 min，110 V 70 min)電泳，恒流(200 mA、60 min)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶800)于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，室溫下水平搖床孵育二抗(1∶1 000)1 h，TBST漂液，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)MDR1、P-gp、Wnt2及β-catenin蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fn上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力

相較于對(duì)照組，BCC組結(jié)直腸癌細(xì)胞活力明顯增加(P<0.05)。給予不同濃度5-FU干預(yù)后，各組結(jié)直腸癌細(xì)胞活力均降低，且呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相同劑量的5-FU干預(yù)后，BCC組細(xì)胞活力均較對(duì)照組高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

*：與相同濃度對(duì)照組相比，P<0.05；#：與0 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05；△：與20 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05；▲：與40 μmol·L-1 5-FU相比，P<0.05圖1 Fn與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116共培養(yǎng)上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力

2.2 Fn影響5-FU抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成能力

相較于對(duì)照組，BCC組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預(yù)后，5-FU組和BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成數(shù)量均明顯減少，但BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成數(shù)量較5-FU組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：各組細(xì)胞集落形成情況；b：各組細(xì)胞集落計(jì)數(shù)定量圖*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖2 Fn與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成

2.3 Fn影響5-FU誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

BCC組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡數(shù)量較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預(yù)后，5-FU組和BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，且BCC+5-FU組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡數(shù)量較5-FU組減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

a：各組細(xì)胞凋亡情況；b：各組細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)定量圖*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖3 Fn與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

2.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路及化療耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，BCC組結(jié)直腸癌細(xì)胞中MDR1、P-gp、Wnt2、β-catenin蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.05)。給予60 μmol·L-15-FU干預(yù)后，5-FU組上述蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)。與BCC組相比，BCC+5-FU組和5-FU組上述蛋白表達(dá)不同程度降低，但BCC+5-FU組MDR1、P-gp、Wnt2、β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于5-FU組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖；b：相關(guān)蛋白表達(dá)定量圖*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與BCC組相比，P<0.05；△：與5-FU組相比，P<0.05圖4 FN與結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116共培養(yǎng)拮抗5-FU激活化療耐藥蛋白表達(dá)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約20%的癌癥與傳染性病原體有關(guān)[12]，如人乳頭瘤病毒與宮頸癌有關(guān)，幽門螺桿菌與胃癌有關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明Fn在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13-14]。Ma等[11]使用Fn感染結(jié)直腸癌細(xì)胞NCM460發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Wu等[15]建立ApcMin/+mice小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在患者近端結(jié)直腸癌組織中提取Fn進(jìn)行為期8周的細(xì)菌飼喂實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Fn能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。本研究建立Fn與結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞集落形成，減少細(xì)胞凋亡，還能夠拮抗5-FU，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療耐藥性和增殖能力，Wnt/β-catenin信號(hào)通路過(guò)度激活調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MRP1及P-gp)高表達(dá)可能是其潛在的分子機(jī)制。

由于結(jié)直腸癌起病隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期或伴有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，因此，聯(lián)合化療具有極其重要的輔助治療價(jià)值[2-3]。FOLFOX(亞葉酸鈣、5-FU、奧沙利鉑)化療方案是目前晚期結(jié)直腸癌患者重要的一線化療方案之一[3]。在根治術(shù)后接受標(biāo)準(zhǔn)5-FU輔助化療的晚期結(jié)直腸癌患者中，高Fn豐度與患者的臨床病理特征及腫瘤復(fù)發(fā)狀態(tài)密切相關(guān)[16]。本研究在對(duì)照組和BCC組基礎(chǔ)上給予5-FU干預(yù)后，細(xì)胞集落形成均明顯下調(diào)，且細(xì)胞凋亡水平明顯升高；此外，BCC+5-FU組中細(xì)胞活力、集落形成的抑制作用和凋亡促進(jìn)作用均較5-FU組明顯減輕。提示腫瘤細(xì)胞與Fn共培養(yǎng)對(duì)化療藥物具有拮抗作用，可以削弱化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，減少腫瘤細(xì)胞凋亡。Yu等[2]利用生物信息和功能學(xué)研究比較了共培養(yǎng)和不培養(yǎng)Fn的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29的基因表達(dá)譜，結(jié)果證實(shí)Fn促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性。

MDR1及P-gp是ATP結(jié)合盒式外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族重要成員，其過(guò)表達(dá)被證明是產(chǎn)生化療耐藥最常見(jiàn)的機(jī)制之一，能使得大量結(jié)構(gòu)、功能不同的抗癌藥物(如5-FU、奧沙利鉑等)被排出腫瘤細(xì)胞，是發(fā)揮化療耐藥作用的關(guān)鍵外排蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞MDR1及P-gp蛋白表達(dá)，具有拮抗5-FU、誘導(dǎo)化療耐藥的作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是ABCB1、MDR1及P-gp等耐藥蛋白的上游調(diào)節(jié)通路，是結(jié)直腸癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥的重要分子機(jī)制[17]。An等[18]在腸道益生菌的化療增敏研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和5-FU聯(lián)合處理結(jié)直腸癌細(xì)胞可以激活caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮潛在的抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與Fn共培養(yǎng)能上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞Wnt2、β-catenin蛋白表達(dá)，且具有拮抗5-FU、誘導(dǎo)化療耐藥的作用。Rubinstein等[19]研究證實(shí)，F(xiàn)n通過(guò)FadA黏附蛋白與膜聯(lián)蛋白A正反饋誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，還發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n能夠通過(guò)分泌FadA誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，且該過(guò)程中伴有Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。為了探究Fn介導(dǎo)的生長(zhǎng)刺激，有研究利用Fn同時(shí)感染表達(dá)E-cadherin的肺癌細(xì)胞PC-9、前列腺癌細(xì)胞22RV1和乳腺癌細(xì)胞MCF7及不表達(dá)E-cadherin的膀胱癌細(xì)胞UMUC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n的生長(zhǎng)刺激作用主要是通過(guò)介導(dǎo)FadA黏附蛋白與E-cadherin結(jié)合，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，導(dǎo)致β-catenin核易位和炎癥基因、Wnt基因、癌基因c-Myc以及Cyclin D1的過(guò)表達(dá)[19]。

值得注意的是，F(xiàn)n能夠分泌多種黏附蛋白(如黏附素Fap2)，特異性結(jié)合GalGalNAc糖殘基，而GalGalNAc糖殘基被證實(shí)能在結(jié)直腸癌組織中過(guò)表達(dá)。這種由Fn介導(dǎo)形成的生物膜，可聚集大量機(jī)會(huì)致病菌，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[21]。但是體內(nèi)外環(huán)境的不同導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)很難精準(zhǔn)評(píng)估聚集多種致病菌的生物膜在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，人體與嚙齒類動(dòng)物的腸道菌群具有極大的異質(zhì)性，因此建立嚙齒類動(dòng)物模型用于人體消化道系統(tǒng)Fn定植研究存在一定的局限性[22]。

綜上所述，F(xiàn)n能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療產(chǎn)生耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。本研究是關(guān)于化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞耐藥問(wèn)題的良好探索，為晚期結(jié)直腸癌患者化療效果預(yù)測(cè)及臨床個(gè)性化干預(yù)提供了一定的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。