丁燕鵬 劉諾敏 陳夢(mèng)戈 方 莎 向文彬 於海軍

武漢大學(xué)中南醫(yī)院放化療科/湖北省腫瘤生物學(xué)行為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心湖北 武漢 430071

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)第二大常見癌癥，全球新診斷病例約43萬例［1］。其中淺表型腫瘤約占70%，可行經(jīng)尿道膀胱切除術(shù)（transurethral resection of the bladder,TURB）治療；雖然淺表型一般不會(huì)危及生命，但其復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高［2］。而伴有肌肉浸潤(rùn)的患者預(yù)后差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高［3］。以順鉑為基礎(chǔ)的全身化療目前仍是膀胱癌晚期及轉(zhuǎn)移性患者的一線治療手段，但該治療的復(fù)發(fā)率未見改善［4］。此外，半數(shù)伴有肌肉浸潤(rùn)的患者不宜使用順鉑治療，對(duì)于這些患者尚無有效的標(biāo)準(zhǔn)治療方法［5］。膀胱癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制目前尚不清楚，探討本病的發(fā)病機(jī)制以及影響預(yù)后的因素具有重要的意義。

偽基因MT 1L屬于金屬硫蛋白（metallothioneins,MTs）家族［6］。已有證據(jù)表明，MTs可以通過結(jié)合重金屬，如鋅/銅［7，8］，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激、抗腫瘤藥物和輻射的影響。在人類中，有4種亞型的MT-2、MT-3和MT-4蛋白質(zhì)是由單個(gè)基因編碼。MT-1A、-1B、-1E、-1F、-1G、-1H、-1M、-1x是屬于MT-1的活性基因。其余MT-1基因（MT-1C、-1D、-1I、-1J、-1L）為偽基因［9］。偽基因是人類基因組中大量存在的一類非編碼RNA，它們控制同源編碼蛋白基因的表達(dá)，但由于編碼序列存在不同類型的突變而不能編碼功能性蛋白［10］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，偽基因在各種疾病中發(fā)揮著重要作用，尤其是在人類的癌癥中［11］。一些與腫瘤相關(guān)的偽基因已被證明是人類癌癥的生物標(biāo)志物。例如，一種名為DUXAP10的偽基因在各種癌癥中上調(diào)。它可通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，并可作為一種獨(dú)立的肝細(xì)胞癌的預(yù)后生物標(biāo)志物［12，13］。此外，一些偽基因也被證實(shí)參與了多種癌癥的進(jìn)展，如乳腺癌、胃癌和膽 囊 癌［14，15］。偽 基 因 在 癌 癥 中 的 重 要 作 用 不 容忽視。

我們從金屬硫蛋白家族中篩選出了與膀胱癌預(yù)后顯著相關(guān)，并與膀胱癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)的偽基因MT 1L，其在膀胱癌中的功能在先前的研究中尚未被闡明。GEPIA和UALCAN等數(shù)據(jù)庫以及R-4.0.2驗(yàn)證了其在人類癌癥中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，TISIDB數(shù)據(jù)庫證實(shí)了MT 1L與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫［16］中篩選出408例膀胱癌患者的臨床隨訪信息和RNA測(cè)序數(shù)據(jù)；剔除總體生存時(shí)間、TNM分期以及腫瘤分級(jí)數(shù)據(jù)不足或缺失的病例。

1.2 GEPIA分析使用基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)（http：//gepia.cancer-pku.cn/）行差異表達(dá)分析，以確認(rèn)MT 1L在不同人類癌癥類型及相應(yīng)正常組織中的表達(dá)水平是否有差異。P＜0.05被認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 TIMER使用腫瘤免疫評(píng)估資源（TIMER）數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）評(píng)估了在膀胱癌中MT 1L表達(dá)與典型免疫細(xì)胞標(biāo)志物的關(guān)系。P＜0.05被認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 TISIDB使用腫瘤免疫系統(tǒng)交互分析的集成門 戶（TISIDB）數(shù) 據(jù) 庫（http：//cis.hku.hk/TISIDB）來推斷膀胱癌中MT 1L的表達(dá)與免疫細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)因子的相關(guān)性，以Spearman相關(guān)系數(shù)ρ＞0.1作為判斷MT 1L表達(dá)對(duì)免疫微環(huán)境影響的基準(zhǔn)。

1.5 UALCAN分析我們利用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu），獲得了在膀胱癌中偽基因MT 1L對(duì)生存的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 基因富集分析（GSEA）本研究旨在揭示MT 1L表達(dá)水平所影響的關(guān)鍵生物學(xué)過程及相關(guān)信號(hào)通路。P＜0.05和富集評(píng)分（NES）＞1.5被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析從TCGA下載了病人的臨床信息，使用R-4.0.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。行邏輯回歸法和多因素Cox回歸分析探討MT 1L在膀胱癌中的預(yù)后價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金屬硫蛋白家族中與膀胱癌生存時(shí)間顯著相關(guān)基因的篩選我們分別使用GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫篩選金屬硫蛋白家族中表達(dá)量在膀胱癌組織與正常組織有顯著差異的基因，結(jié)果顯示在MT 1A～MT 1X中，只有MT 1L符合篩選條件。如圖1A所示，膀胱癌腫瘤組織中MT 1L的表達(dá)水平顯著低于相鄰正常組織，這意味著MT 1L的表達(dá)水平可以將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開來。如圖1B，在膀胱癌中，MT 1L的表達(dá)水平越高，則意味著總體生存時(shí)間（OS）越短（n=406，P=0.002 3）。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析MT1L在正常組織和膀胱癌組織中的表達(dá)水平差異（A）及UALCAN分析MT1L表達(dá)水平與膀胱癌總體生存期的關(guān)系（B）

2.2 MT1L在膀胱癌中的預(yù)后價(jià)值基于TCGA數(shù)據(jù)庫，我們使用邏輯分析探討了偽基因MT 1L表達(dá)水平與膀胱癌的臨床病理特征的相關(guān)性。剔除不合格的病例后，一共有408例納入本次分析。通過邏輯回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)偽基因MT 1L與多種臨床病理特征相關(guān)，具有很好的診斷膀胱癌的價(jià)值。如表1所示，MT 1L的表達(dá)水平與膀胱癌患者的年齡（P=0.039）、體質(zhì)量（P=0.01）、種族（亞洲人vs其他，P=0.043；亞洲人vs白種人，P＜0.001），N（N0vs＞N0，P=0.026）、分期（Ⅰ～ⅡvsⅢ，P＜0.001；Ⅰ～ⅡvsⅣ，P＜0.001）、T分期（＜T 2vsT 3，P＜0.001；＜T 2vsT 4，P=0.001）、分級(jí)（高vs低，P=0.003）相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)偽基因MT 1L的臨床診斷價(jià)值，我們進(jìn)行了多因素Cox分析，如表2所示，MT 1L表達(dá)水平、腫瘤分期和攜瘤狀態(tài)都可作為膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

表1 MT1L的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 各臨床特征的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

2.3 MT1L與膀胱癌中腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān)的淋巴細(xì)胞是預(yù)測(cè)總生存率種必不可少的因素。TISIDB是一個(gè)綜合性的腫瘤免疫分析的網(wǎng)站，整合了五大數(shù)據(jù)庫的資源。因此，我們選擇TISIDB明確在膀胱癌中MT 1L與免疫浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）以及免疫調(diào)節(jié)劑的Spearman相關(guān)性（圖2）。結(jié)果同樣顯示MT 1L與免疫浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞之間的強(qiáng)相關(guān)性，如效應(yīng)CD8+記憶T細(xì)胞（Tem-CD8）（ρ=0.549，P＜0.001），中央CD8+記憶T細(xì)胞（Tcm-CD8）（ρ=0.493，P＜0.001），濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）（ρ=0.619，P＜0.001），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）（ρ=0.708，P＜0.001），自然殺傷T細(xì)胞（NKT）（ρ=0.683，P＜0.001），骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSC）（ρ=0.664，P＜0.001）。另外如圖2中所示，與其他人類癌癥相比，在膀胱癌中MT 1L表達(dá)與TILs之間的整體相關(guān)性最顯著（紅色方塊數(shù)目最多）。對(duì)于免疫抑制劑，MT 1L表達(dá)與CSF1R、HAVCR2、IL 10、PDCD1和PDCD1LG2表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性。因此，MT 1L在腫瘤免疫微環(huán)境中，尤其是在膀胱癌中，是一個(gè)重要而且獨(dú)特的調(diào)節(jié)因子。

圖2 M T1L的免疫調(diào)節(jié)功能分析

2.4 在膀胱癌中MT1L與典型免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性我們通過TIMER數(shù)據(jù)庫探究了MT 1L表達(dá)與典型免疫細(xì)胞標(biāo)志物之間的關(guān)系。如表3所示，在膀胱癌中，MT 1L的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞標(biāo)志物、通用T細(xì)胞標(biāo)志物（CD3E、CD2）、單核細(xì)胞標(biāo)志物（CD86）、自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物（KIR2DL 3、KIRIDL4）、樹突細(xì)胞標(biāo)志物（HLA-DPB1、HLADQB1、HLA-DPA 1）和功能性T細(xì)胞標(biāo)志物，包括輔助性T細(xì)胞（Th1）標(biāo)志物（IFNG、TNF）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）標(biāo)志物（ENTPD1）和T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物（PD-1、CTLA 4）呈顯著正相關(guān)。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)MT 1L與單核細(xì)胞和M 2巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的相關(guān)性，這意味著MT 1L可能在膀胱癌中調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化。

表3 TIM ER數(shù)據(jù)庫分析的M T1L與典型免疫細(xì)胞標(biāo)志物關(guān)系的結(jié)果

另一點(diǎn)值得注意的是，MT 1L與樹突狀細(xì)胞（DCs）標(biāo)志物（NRP1、ITGAX）之間的強(qiáng)烈相關(guān)性。研究證明DCs通過增加Treg細(xì)胞和降低CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［17］。MT 1L的表達(dá)與T細(xì)胞衰竭和Treg標(biāo)志物如LAG3、TIM-3、GZMB、FOXP3、IL 2RA、TGFB1之間存在不可忽視的強(qiáng)相關(guān)性。研究表明，F(xiàn)OXP3作為一個(gè)重要的因子，可以抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞的作用［18］。此外，MT 1L與T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物的相關(guān)性表明，膀胱癌中MT 1L的高表達(dá)T細(xì)胞的衰竭密切相關(guān)。因此，以上結(jié)果證實(shí)了MT 1L在膀胱癌腫瘤微環(huán)境的免疫逃逸中的重要作用。

2.5 GSEA富集分析我們通過GSEA探索了在膀胱癌中MT 1L的表達(dá)水平所影響的關(guān)鍵生物學(xué)功能和相關(guān)的信號(hào)通路。如圖3所示，GO富集分析表明，MT 1L參與腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)，與之前免疫分析的結(jié)果一致。這些結(jié)果再次證實(shí)了MT 1L可能在腫瘤免疫中有著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。

圖3 GSEA富集結(jié)果圖

3 討論

MT 1L是一種在乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)的偽基因［19］。已有學(xué)者證實(shí)MT 1L可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)［20］。然而，關(guān)于MT 1L在膀胱癌中潛在的生物學(xué)影響的文獻(xiàn)非常有限，因此我們進(jìn)行了這次的分析研究。在這里，我們觀察到膀胱癌中MT 1L的表達(dá)低于正常膀胱組織，這意味著MT 1L可以作為一個(gè)生物標(biāo)志物以鑒別腫瘤組織和非腫瘤組織。Logistic回歸分析顯示膀胱癌組織中高M(jìn)T 1L表達(dá)與高T、N分期和高腫瘤分級(jí)有關(guān)。因此，我們可以合理推測(cè)在膀胱癌中MT 1L與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。此外，膀胱癌組織中MT 1L的高表達(dá)與膀胱癌患者較短的總生存時(shí)間顯著相關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox分析證實(shí)MT 1L可以作為BLCA的獨(dú)立預(yù)后因素。

值得注意的是我們發(fā)現(xiàn)了在膀胱癌中，MT 1L的表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞標(biāo)志物以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的水平顯著相關(guān)。近幾年，免疫治療改善了對(duì)泌尿系癌癥（包括晚期膀胱癌）的干預(yù)手段［21］，在膀胱癌中取得了良好的療效。然而不可否認(rèn)的是，只有部分患者可以從免疫治療中獲益。作為一種高免疫原性的惡性腫瘤，膀胱癌的腫瘤免疫微環(huán)境的反應(yīng)紊亂對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著決定性作用。因此膀胱癌的免疫治療目前仍有許多有待解決的問題，尋找影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的有效治療靶點(diǎn)已成為當(dāng)務(wù)之急。本研究表明MT 1L的表達(dá)與TILs浸潤(rùn)之間存在相關(guān)性。在30種腫瘤中，BLCA中MT 1L表達(dá)與TILs的相關(guān)性紅色數(shù)量最多，即相關(guān)性最強(qiáng)（圖2）。而在MT 1L的表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)分子之間的相關(guān)性中也可以發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果。

TISIDB的免疫分析結(jié)果里，有一點(diǎn)吸引了我們的注意；在膀胱癌中，MT 1L的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的浸潤(rùn)水平（ρ=0.708）和骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSCs）的浸潤(rùn)水平（ρ=0.664）強(qiáng)相關(guān)。而膀胱癌的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是Tregs和MDSCs等免疫細(xì)胞顯著浸潤(rùn)［22，23］。Tregs和MDSCs是BLCA中抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們的存在與較差的臨床結(jié)局的相關(guān)性已得到多位學(xué)者的證實(shí)［24，25］。Tregs作為重要的免疫抑制因子，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，抑制抗腫瘤免疫，并有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃避［26］。同樣，MDSCs在腫瘤微環(huán)境中分布非常廣泛，具有較強(qiáng)的免疫抑制活性，可以抑制細(xì)胞毒T細(xì)胞的增殖和活化，導(dǎo)致抗腫瘤免疫反應(yīng)失效，并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和化療耐受［27］。因此，我們認(rèn)為MT 1L在調(diào)節(jié)腫瘤免疫中起著至關(guān)重要的作用。

同樣，免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物與MT 1L表達(dá)之間的關(guān)系也意味著MT 1L在調(diào)節(jié)膀胱癌的腫瘤免疫微環(huán)境中具有重要意義。根據(jù)TIMER的分析，MT 1L的表達(dá)與T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物（PD-1、CTLA 4）呈正相關(guān)。正常情況下，PD-L 1/PD-1相互作用可抑制CD8+T細(xì)胞的增殖和T細(xì)胞受體（TCR）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能，從而避免自身免疫，減弱炎癥反應(yīng)［21］。PD-L 1與T細(xì)胞表面受體PD-1結(jié)合會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能的障礙，并導(dǎo)致T細(xì)胞的功能失活［28］。然而在膀胱癌中，MT 1L的高表達(dá)水平與免疫細(xì)胞高浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)的同時(shí)，卻也提示了較差的臨床結(jié)局，這似乎是矛盾的；然而MT 1L的過表達(dá)與T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物之間的正相關(guān)為這個(gè)看似矛盾的現(xiàn)象提供了合理的解釋。

此外，MT 1L與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和M 2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物也具有很強(qiáng)的相關(guān)性，特別是與M 2巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物。TAM是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其通過介導(dǎo)免疫抑制，促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，甚至參與腫瘤的耐藥［29-31］。TAM可分化為M 1巨噬細(xì)胞或M 2巨噬細(xì)胞表型。臨床研究表明腫瘤患者的不良預(yù)后與M 2巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著相關(guān)［32］。而本研究中，MT 1L的表達(dá)與M 2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的強(qiáng)相關(guān)性表明MT 1L可能參與巨噬細(xì)胞的極化，也部分解釋了高表達(dá)MT 1L的膀胱癌患者預(yù)后不良的可能機(jī)制。因此，靶向MT 1L可減少TAM的浸潤(rùn)，特別是M 2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些證據(jù)明確了MT 1L作為一種新的靶向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的生物標(biāo)志物的功能，為膀胱癌的免疫治療提供了新的思路。

綜上所述，金屬硫蛋白家族中，只有偽基因MT 1L與膀胱癌的預(yù)后和免疫微環(huán)境相關(guān)，高表達(dá)MT 1L的膀胱癌患者Treg和MDSCs浸潤(rùn)水平較高，T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和M 2巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)水平也較高，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸，抑制T細(xì)胞的活化并且參與腫瘤的耐藥過程。因此，高表達(dá)MT 1L的膀胱癌患者其預(yù)后較差，MT 1L可以作為預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。然而，本研究缺少實(shí)驗(yàn)的支持，因此我們也非常期待其他學(xué)者關(guān)于MT 1L在膀胱癌中的進(jìn)一步研究。