劇慧棟，裴艷濤，趙田湉，趙 晨，蔣瑞萍

弓形桿菌(Arcobacter)是弓形桿菌屬的統(tǒng)稱，屬于ε-變形菌綱彎曲桿菌科，該屬目前已發(fā)現(xiàn)25種，其中嗜低溫弓形桿菌(Arcobactercryaerophilus)、斯氏弓形桿菌(Arcobacterskirrowii)、布氏弓形桿菌(Arcobacterbutzleri)可以導(dǎo)致人類敗血癥、腹瀉和動(dòng)物流產(chǎn)、胃腸功能紊亂等疾病[1]，是一種潛在的人獸共患食源性病原體。2002年，食品微生物國(guó)際委員會(huì)將布氏弓形菌列入嚴(yán)重影響人類健康的病原[2]。引起弓形桿菌感染的主要途徑是人類攝入受污染的動(dòng)物源性食品、水及其他食品，攜帶弓形桿菌的狗、貓也可以感染人類[3]。國(guó)外對(duì)該菌的毒力基因有一定的研究，國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域研究很少。本研究對(duì)石家莊地區(qū)采自市售食品中的71株弓形桿菌的9種毒力基因擴(kuò)增檢測(cè)，以便了解石家莊地區(qū)弓形桿菌種毒力基因的分布情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018-2019年在石家莊市每個(gè)縣、區(qū)各選擇1～2個(gè)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)進(jìn)行樣品采集，每個(gè)采樣地點(diǎn)采集禽肉、畜肉、熟食、水產(chǎn)品、環(huán)境等各類樣品10份，從采集的生鮮雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、羅非魚、鯉魚、蟶子、螃蟹、魚丸、蟠桃、集貿(mào)市場(chǎng)操作桌面，共分離布氏弓形桿菌66株，嗜低溫弓形桿菌5株，弓形桿菌的檢出率為19.72%，見表1。

表1 71株弓形桿菌菌株來源 Tab.1 Arcobacter strains used in the study

1.2 試劑與儀器 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)，毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(德國(guó)Qiagen)，生物安全柜(美國(guó)Thermo)，三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder)，振蕩器(其林貝爾公司)，微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(德國(guó)Bruker)。

弓形桿菌檢測(cè)試劑盒、哥倫比亞血平板均購(gòu)自青島中創(chuàng)生物科技有限公司，TaqTM購(gòu)自寶生物工程有限公司，QIAxcel DNA Screening Kit和DNA Marker購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，引物合成和測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 菌株的分離鑒定

1.3.1 菌株的培養(yǎng) 所有菌株在哥倫比亞血平板上劃線，于37 ℃微需氧環(huán)境(5% O2、10% CO2和85% N2)中倒置培養(yǎng)48 h；用一次性無菌接種針純培養(yǎng)后的單菌落均勻涂抹在MALDI 靶板的樣本孔位中，自然晾干；在干燥后的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本上加1 μL基質(zhì)溶液，自然晾干；放入Bruker微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定[4]。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 9種目的基因的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司公司合成。引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度[5]，見表2。

表2 引物序列及其擴(kuò)增片段大小Tab.2 Primers for amplifications of ciaB, cj1349, pldA, irgA, hecA, tlyA, mviN, hecB genes

1.3.3 DNA模板制備 弓形桿菌DNA模板制備可采用水煮法進(jìn)行。取一環(huán)新鮮培養(yǎng)的弓形桿菌分離株培養(yǎng)物(10 μL)，加入200 μL無菌生理鹽水中，振蕩混勻，13 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加入100 μL超純水，振蕩混勻，在沸水中煮10 min，立刻放在冰上冷卻，13 000 r/min離心2 min，吸取上清，-20 ℃保存，備用[6]。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)的總體系為50 μL，具體如下：2 μL DNA模板，0.3 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL), 4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，5 μL正反向引物(10 μmol/L) ，5 μL 10×Taq Buffer(Mg2+Free)，3 μL MgCl2(25 mmol/L)，其余用水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.5 PCR產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物電泳采用Qiaxcel毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行分析[4]。

2 結(jié) 果

2.1 致病基因在弓形桿菌中的分布 見表3。

表3 致病基因在弓形桿菌中的分布Tab.3 Distribution of pathogenic genes in Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter butzleri

2.2 單種菌攜帶致病基因數(shù)量 見表4。

表4 單種菌攜帶致病基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.4 Number of pathogenic genes associated with 71 Arcobacter strains

2.3 不同來源菌株中致病基因分布情況 見表5。

表5 不同來源菌株中致病基因分布統(tǒng)計(jì)Tab.5 Distribution of pathogenic genes in strains from different sources

3 討 論

弓形桿菌嚴(yán)重威脅人類健康。本研究共采集71株弓形桿菌菌株，其中66株布氏弓形桿菌，5株嗜低溫弓形桿菌。通過對(duì)布氏弓形桿菌和嗜低溫弓形桿菌所攜帶的cadF(纖連蛋白)、ciaB(侵襲性抗原)、cj1349(纖連蛋白)、pldA(磷脂酶A)、mviN(肽聚糖生物合成)、tlyA(溶血素)、hecB(溶血素活化蛋白)、hecA(涉及攻擊、聚集和細(xì)胞死亡的絲狀血凝素)和irgA(鐵離子調(diào)控的外膜蛋白)[7]9種致病基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，本研究中布氏弓形桿菌ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF基因攜帶率在70.42%和90.91%之間，irgA、hecA、hecB基因攜帶率為3.03%～9.09%，在巴西Maria等和波蘭Zacharow等的研究中，ciaB、mviN、tlyA和pldA基因攜帶率達(dá)到90%以上，cj1349在巴西布氏弓形桿菌中攜帶率高達(dá)98.1%，波蘭布氏弓形桿菌中攜帶率為71%，cadF基因在波蘭布氏弓形桿菌中攜帶率為90%，在巴西布氏弓形桿菌中攜帶率為72.7%[3,6]，irgA、hecA、hecB基因在國(guó)外布氏弓形桿菌種攜帶率介為34%～53%，本研究中irgA、hecA、hecB基因在布氏弓形桿菌的攜帶率明顯低于巴西和波蘭該菌的攜帶率，ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF的攜帶率與與巴西和波蘭布氏弓形桿菌攜帶率稍低[8]。

本研究嗜低溫弓形桿菌9個(gè)致病基因的攜帶率明顯低于布氏弓形桿菌，5株嗜低溫弓形桿菌攜帶ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF基因，攜帶率分別是80%、80%、40%、40%、20%和60%，不攜帶irgA、hecA、hecB基因，在波蘭Zacharow等人的研究中，2株嗜低溫弓形桿菌中僅分布有ciaB基因[6]，捷克David等在13株嗜低溫弓形桿菌中檢測(cè)到ciaB、MviN、tlyA3種基因，攜帶率分別是92.3%、84.6%和15.4%[9]，與石家莊地區(qū)嗜低溫弓形桿菌攜帶致病基因相比，國(guó)外嗜低溫弓形桿菌致病基因的攜帶率較低，考慮到本次所采集到的嗜低溫弓形桿菌數(shù)量較少，不能完全反應(yīng)9種致病基因在嗜低溫弓形桿菌的分布情況，因此需要在今后實(shí)驗(yàn)中采集更多嗜低溫弓形桿菌以期得到更客觀的數(shù)據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)在71株弓形桿菌中僅有3株布氏弓形桿菌未攜帶上述9種致病基因，而大多從食品和環(huán)境分離出來的布氏弓形桿菌和嗜低溫弓形桿菌都含有2～8致病基因，70%以上的菌株中分布有至少5個(gè)致病基因，其中16株攜帶5個(gè)致病基因，30株攜帶6個(gè)致病基因,7株攜帶7個(gè)致病基因，1株攜帶8個(gè)致病基因，說明采自石家莊地區(qū)的弓形桿菌絕大多數(shù)都致病，而且很多致病菌因?yàn)閿y帶多個(gè)致病基因造成其具有較強(qiáng)的毒力，因此需要加強(qiáng)對(duì)石家莊地區(qū)市售生鮮肉食、海鮮、環(huán)境中弓形桿菌的檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的超市、集貿(mào)市場(chǎng)等銷售場(chǎng)所進(jìn)行有針對(duì)性的消毒以控制弓形桿菌的傳播預(yù)防由此引發(fā)的食物中毒很有必要。

利益沖突：無

引用本文格式：劇慧棟，裴艷濤，趙田湉，等. 2018-2019年石家莊市弓形桿菌致病基因的分布及其特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：643-648. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.082