王 天，徐紅紅，張林吉，王學(xué)鋒，張小榮，吳艷濤，巢國(guó)祥，4

沙門(mén)氏菌是重要的人獸共患病原菌，沙門(mén)氏菌的防控是個(gè)令人關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。近年來(lái)動(dòng)物源印第安納沙門(mén)氏菌泛耐藥克隆(ST17克隆)的出現(xiàn)和傳播，導(dǎo)致人類(lèi)沙門(mén)氏菌病例增加，成為公共衛(wèi)生存在的新威脅[2-3]。

沙門(mén)氏菌擁有的血清型數(shù)量繁多，不同血清型的抗生素耐藥性以及致病性之間均存在差異[5]。耐藥基因既可以存在于細(xì)菌染色體上，也可以存在于細(xì)菌質(zhì)粒上。質(zhì)粒是在多數(shù)G-細(xì)菌中廣泛存在的一種染色體外的遺傳因子，質(zhì)粒特性使細(xì)菌更易獲得抗生素耐藥性、增強(qiáng)細(xì)菌的致病性、代謝能力等多種特性[4]，并具增強(qiáng)細(xì)菌耐藥基因傳播能力。耐藥I類(lèi)整合子、轉(zhuǎn)座子Tn3、TnsA、插入序列IS26、IS91作為細(xì)菌中存在的重要可移動(dòng)元件，可對(duì)外源基因進(jìn)行捕獲和表達(dá)(尤其是存在于質(zhì)粒上的整合子及移動(dòng)元件)[5-6]。盛煥精等[7]通過(guò)質(zhì)粒接合的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明菌株攜帶的質(zhì)粒類(lèi)型和相應(yīng)的耐藥表型存在關(guān)聯(lián)，并且耐藥基因可通過(guò)接合作用在不同種屬細(xì)菌間傳播，使受體菌獲得耐藥性。質(zhì)粒消除試驗(yàn)可確認(rèn)相應(yīng)耐藥基因在質(zhì)粒上的存在，并可檢測(cè)其在質(zhì)粒上的穩(wěn)定性[8]。JI XM等通過(guò)質(zhì)粒的消除試驗(yàn)證實(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌耐藥中的重要作用[9]。

本研究通過(guò)對(duì)泛耐藥的ST17型動(dòng)物源性印第安納沙門(mén)氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序并結(jié)合NCBI基因庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)布的動(dòng)物源性泛耐藥印第安納沙門(mén)氏菌全基因序列的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、耐藥I類(lèi)整合子及移動(dòng)元件、耐藥基因。 通過(guò)質(zhì)粒消除試驗(yàn)分析多株多重耐藥沙門(mén)氏菌耐藥性表型、耐藥基因攜帶前后的變化并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒接合試驗(yàn)結(jié)果，以進(jìn)一步證實(shí)質(zhì)粒在沙門(mén)氏菌尤其是印第安納沙門(mén)氏菌泛耐藥性的存在和傳播中所發(fā)揮的作用。 同時(shí)與基因庫(kù)中其它腸桿菌科質(zhì)粒通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性分析，進(jìn)一步探索印第安納沙門(mén)氏菌泛耐藥克隆的起源。

1 材料與方法

1.1 菌株信息 來(lái)源于前期實(shí)驗(yàn)室研究8株沙門(mén)氏菌菌株，其中動(dòng)物源性印第安納沙門(mén)氏菌ST17克隆菌株3株(編號(hào)分別為15、38、222)，腸炎沙門(mén)氏菌1株(編號(hào)為17)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌1株(編號(hào)為32)、德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌1株(編號(hào)為163)[3]。

1.2 方 法

1.2.1 全基因組測(cè)序、組裝 利用TAKARA DNA提取試劑盒提取菌株DNA，使用PacBio○RRS II System進(jìn)行全基因組測(cè)序(NGS)。序列拼接使用SPAdes-3.5.0軟件對(duì)預(yù)處理后的IllumIna 數(shù)據(jù)和PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的全基因NGS測(cè)序菌株為印第安納沙門(mén)氏菌株15(GenBank：CP092259.1)，222(GenBank：CP031190)。

1.2.2 質(zhì)粒同源性和結(jié)構(gòu)分析 選擇3株來(lái)源于國(guó)內(nèi)動(dòng)物源性印第安納沙門(mén)氏菌研究的菌株D90(GenBank: CP022450.1)[10]、 C629(GenBank:CP015724.1)[11]、SI67(GenBank:CP050783.1)[12]進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)分析。通過(guò)NCBI以菌株15 plasmid-1全序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性最高的菌株(Query Cover>85%、Per.ident>99%)溯源分析。耐藥基因使用CARD (https://card.mcmaster.ca/anaiyze) 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。SNP分析使用CSI Phylogeny 1.4(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny)[13]?；蚪M圈圖繪制使用Blast Ring Image Generator繪制[14]。

1.2.3 質(zhì)粒消除 采用高溫SDS質(zhì)粒消除的方法[8]： 菌株復(fù)蘇后接種于5 mL的無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。取50 μL接種于2 mL的5.00% SDS LB液體培養(yǎng)基中，搖床內(nèi)37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取50 μL接種于2 mL的無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中，搖床內(nèi)43 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，此為一輪質(zhì)粒消除結(jié)束，重復(fù)上述步驟進(jìn)行多輪消除。與5 mL的無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基中，并在搖床內(nèi)37 ℃、220 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，于甘油管-80 ℃內(nèi)保存。

1.2.4 耐藥基因的PCR檢測(cè) 使用PCR擴(kuò)增TEM-1、CTX-M、bla-OXA、sul1、aacC4、aac6-1b、dfrA17、floR、tet(A)、tet(G)、qnrB、qnrS等12種耐藥基因。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用自動(dòng)化微量肉湯稀釋法，使用藥敏板進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)：頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺硫霉素(IPM)、四環(huán)素(TE)、頭孢唑啉(CFZ)頭孢西丁(FOX)、慶大霉素(CN)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(C)、環(huán)丙沙星(CIP)、萘啶酸(NA)、阿奇霉素(AZM)、阿米卡星(AK)、卡那霉素(K)共 14 種。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI 2017) 判斷結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 全基因測(cè)序的結(jié)果分析 本研究進(jìn)行的全基因NGS測(cè)序菌株222和15的結(jié)果顯示菌株222全基因組中含有1個(gè)染色體(GenBank:CP031189)和2個(gè)質(zhì)粒。質(zhì)粒222-scf71810(GenBank:CP031190)長(zhǎng)308622 bp攜帶有27種耐藥基因、2個(gè)耐藥I類(lèi)整合子。染色體上僅有emrR、gols和aac6-Iy3個(gè)耐藥基因和一些非特異性的外排泵類(lèi)抗生素抗性相關(guān)基因，另一個(gè)質(zhì)粒攜帶有一個(gè)耐藥基因CTX-M。菌株15全基因組中含有1個(gè)染色體和4個(gè)質(zhì)粒，染色體長(zhǎng)4 740 845 bp，其中一個(gè)大質(zhì)粒15-plasmid1長(zhǎng)214 299 bp，攜帶有22種耐藥基因、1個(gè)耐藥I類(lèi)整合子。菌株15 的染色體上僅有g(shù)ols、aac6-Iy兩個(gè)耐藥基因和一些非特異性的外排泵類(lèi)抗生素抗性相關(guān)基因，其他質(zhì)粒上并無(wú)耐藥基因存在。3株來(lái)源于國(guó)內(nèi)動(dòng)物源性印第安納沙門(mén)氏菌研究的質(zhì)粒pD90-1(GenBank:CP022451.1)全長(zhǎng)3 222 470 bp含有23種耐藥基因和1個(gè)耐藥I類(lèi)整合子；pC629(GenBank:CP015725.1)全長(zhǎng)210 106 bp，攜帶有24種耐藥基因和2個(gè)耐藥I類(lèi)整合子；pSI67-1(GenBank:CP050784.1)全長(zhǎng)255 307 bp，攜帶有19種耐藥基因和2個(gè)耐藥I類(lèi)整合子。同時(shí)5個(gè)質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu)十分相似且均大于210 000 bp(圖1、圖2)。以上質(zhì)粒都攜帶了大量的轉(zhuǎn)移酶、Tn、IS等可移動(dòng)元件并分布于耐藥基因兩側(cè),數(shù)量最多的可移動(dòng)元件是插入序列IS26，其次是IS6和IS91。質(zhì)粒15 plamisd1、pC629、pD90-1、pSI67-1分別攜帶2-3種轉(zhuǎn)座子，質(zhì)粒222-scf71810攜帶了近10種轉(zhuǎn)座子(圖1)。

注：紅色方塊表示抗生素耐藥基因。藍(lán)色方塊表示插入序列、轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座酶相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。綠色方塊表示整合酶(圖中方塊大小不代表序列長(zhǎng)度)。圖1 質(zhì)粒pSI67-1(GenBank:CP050784.1)、222-scf71810(GenBank:CP031190)、pD90-1(GenBank:CP022451.1)、pC629(GenBank:CP015725.1)和質(zhì)粒15-plasmid1的序列結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Sequence structural features of plasmids pSI67-1 (GenBank:CP050784.1), 222-scf71810 (GenBank:CP031190.1), pD90-1 (GenBank:CP022451.1), pC629 (GenBank:CP015725.1) and plasmid 15-plasmid1

2.2 質(zhì)粒同源性溯源結(jié)果 基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)粒15-plasmid1的 Blastn結(jié)果顯示其他的腸桿菌中也同樣存在與本研究中相似的大質(zhì)粒，其中相似度最高的32株菌株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)中包含了10株大腸桿菌、10株印第安納沙門(mén)氏菌、9株鼠傷寒沙門(mén)氏菌、3株腸炎沙門(mén)氏菌、1株志賀菌。33株質(zhì)粒均擁有高度相似的結(jié)構(gòu)(圖2)，其中最大質(zhì)粒是來(lái)自中國(guó)浙江的大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒pHZ003(GenBank:MN476094.1)全長(zhǎng)320 681 bp；最小的是來(lái)自中國(guó)浙江的印第安納沙門(mén)氏菌攜帶的質(zhì)粒pTB501(GenBank:CP034820.1)全長(zhǎng)188 527 bp。本文3株印第安納沙門(mén)氏菌攜帶質(zhì)粒也包含在其中。15-plasmid1和pD90-1同源性最高、222-scf71810和SI67同源性最高(圖3)。33株腸桿菌攜帶的耐藥基因主要包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因：TEM-1和OXA-1、磺胺類(lèi)耐藥基因：sul1、sul2氨基糖苷類(lèi)耐藥基因：Aph(6)-Id、Aph(3″)-Ib、Aph(4)-Ia、aacC4、aac(6)-Ib、氯霉素類(lèi)耐藥基因catB3、季銨類(lèi)耐藥基因QacEΔ1，其中有28個(gè)質(zhì)粒都攜帶有耐藥I類(lèi)整合子(圖3)。

注：基于質(zhì)粒15 plasmid1全序列BLAST結(jié)果中同源性最高的前32株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)使用Blast Ring Image Generator繪制的基因組圈圖(紅色：印第安納沙門(mén)氏菌、黃色：鼠傷寒沙門(mén)氏菌、藍(lán)色：腸炎沙門(mén)氏菌、黑色：大腸桿菌、綠色：志賀菌)。圖2 33株腸桿菌質(zhì)粒BRIG(Blast Ring Image Generator)比對(duì)結(jié)果FIg.2 Blast Ring Image Generator results of 33 strains of Enterobacteriaceae plasmids

基于質(zhì)粒15 plasmid1全序列BLAST結(jié)果中同源性最高的前32株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)繪制的NJ進(jìn)化樹(shù)，菌株編號(hào)標(biāo)灰的部分是前文中的5個(gè)質(zhì)粒pSI67-1、222-scf71810、pD90-1、pC629(GenBank:CP015725)和15-plasmid1。圖3 33株腸桿菌質(zhì)粒SNP的Neighbor-Joining (NJ)進(jìn)化樹(shù)與耐藥基因攜帶情況Fig.3 Neighbor-Joining (NJ) tree of 33 Enterobacteriaceae plasmid SNPs and resistance-genes carriage

2.3 質(zhì)粒消除前后耐藥基因變化 經(jīng)質(zhì)粒消除試驗(yàn)后，菌株15不再攜帶TEM-1、OXA-1、sul1、aacC4、dfrA17、floR、qnrB等7種耐藥基因，菌株38不再攜帶TEM-1、bla-CTX-M、OXA-1、sul1、aacC4、dfrA17、floR，菌株222不再攜帶TEM-1、OXA-1、sul1、aacC4、aac6-1b。而菌株17攜帶的TEM-1，菌株32攜帶的floR和tet(G)，菌株163攜帶的sul1等耐藥基因被消除(表1)。

表1 質(zhì)粒消除前后耐藥基因攜帶情況Tab.1 Carriage of resistant genes before and after plasmid elimination

2.4 質(zhì)粒消除前后耐藥性變化 在我們檢測(cè)的14種抗生素中質(zhì)粒消除前印第安納沙門(mén)氏菌均對(duì)其中的9種以上的抗生素表現(xiàn)出耐藥性。質(zhì)粒消除試驗(yàn)后，菌株15 和菌株38對(duì)TE、CN、CIP、AZM、AK等抗生素恢復(fù)敏感，菌株222對(duì)CTX、CN、CIP、NA、K等抗生素恢復(fù)敏感。而其他的3種血清型的沙門(mén)氏菌耐藥性改變較小，其中菌株17 和菌株32的耐藥性沒(méi)有改變(表2)。

表2 6株沙門(mén)氏菌質(zhì)粒消除前后耐藥性情況Tab.2 Phenotypic resistance profiles of 6 strains of Salmonella before and after plasmid elimination

3 討 論

印第安納沙門(mén)氏菌是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的泛耐藥克隆[3]。本研究結(jié)果表明印第安納沙門(mén)氏菌攜帶有200 000 bp左右的大質(zhì)粒，這些質(zhì)粒高度相似同源。該質(zhì)粒攜帶有1個(gè)以上的耐藥I類(lèi)整合子、整合酶及多個(gè)轉(zhuǎn)座子Tn及多個(gè)插入序列IS。質(zhì)粒上的耐藥基因大部分都位于耐藥I類(lèi)整合子上，在所有的耐藥基因和耐藥基因簇的兩側(cè)都分布了Tn3、IS26、IS6等轉(zhuǎn)座酶和插入序列。耐藥I類(lèi)整合子有強(qiáng)大的從其它細(xì)菌或環(huán)境中獲得耐藥基因能力，而整合酶、轉(zhuǎn)座子、插入序列更進(jìn)一步加強(qiáng)了質(zhì)粒對(duì)耐藥基因的捕獲能力。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，印第安納沙門(mén)氏菌耐藥I類(lèi)整合子遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它如腸炎、鼠傷寒等沙門(mén)氏菌[15，17]，而本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明攜帶耐藥I類(lèi)整合子的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率顯著高于沒(méi)有耐藥I類(lèi)整合子的質(zhì)粒，且含有耐藥I類(lèi)整合子的質(zhì)粒更容易在菌株之間水平傳播進(jìn)而獲得耐藥基因[18]。質(zhì)粒本身除了在耐藥基因的獲得中發(fā)揮作用，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移等作用增加了細(xì)菌耐藥性的傳播。正是這種大質(zhì)粒的存在并被印第安納沙門(mén)氏菌獲得而導(dǎo)致印第安納沙門(mén)氏菌泛耐藥克隆的形成。

本研究中質(zhì)粒存在許多相似的遺傳結(jié)構(gòu)：如由sul1—qacEΔ1—Arr-3—CatB3—bla-OXA-1—AAC(6′)-Ib-cr6—aacC4-Aph(4)-Ia組成的耐藥基因簇；I類(lèi)整合酶附近的IS26-aadA5-dfrA17-IntI1;由IS26-oqxA-oqxB-IS26組成的操縱子oqxRAB；而這些結(jié)構(gòu)在其他的菌株如大腸桿菌質(zhì)粒pAH01-4(GenBank:CP055255.1)、奇異變形桿菌MPE0734(CP053615.1)均有多個(gè)高度相似的序列，且耐藥基因的位置分布也具有相似的特點(diǎn)。腸桿菌質(zhì)粒的NJ進(jìn)化樹(shù)(圖3)結(jié)果表明這種質(zhì)粒與腸桿菌中存在的相似質(zhì)粒高度同源。大多存在于大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中，推測(cè)這種質(zhì)粒來(lái)源于大腸桿菌。且這種質(zhì)粒有向其他腸桿菌水平傳播的可能與趨勢(shì)。

高溫SDS的消除機(jī)制為破壞細(xì)胞膜完整性，改變質(zhì)粒在細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致耐藥質(zhì)粒因不能完成正常的復(fù)制及分配到子代細(xì)胞[16]不會(huì)影響染色體上的耐藥基因。質(zhì)粒消除后菌株耐藥性的改變說(shuō)明在泛耐藥印第安納沙門(mén)氏菌中對(duì)CTX、TE、CN、CIP、AZM、AK、K等多種抗生素耐藥性發(fā)揮決定作用的是存在其質(zhì)粒上耐藥基因。印第安納沙門(mén)氏菌多數(shù)耐藥基因被消除，消除效果較高，說(shuō)明這類(lèi)位于核苷酸上的基因不穩(wěn)定，進(jìn)一步說(shuō)明這類(lèi)耐藥基因最大可能是位于質(zhì)粒上。本研究中同樣的耐藥基因在不同的菌株中的消除情況并不相同。消除劑的濃度以及初始的菌液濃度等因素均會(huì)對(duì)質(zhì)粒消除的效果產(chǎn)生影響[8]。其他血清型的沙門(mén)氏菌的耐藥性并沒(méi)有隨著質(zhì)粒消除發(fā)生明顯的抗生素恢復(fù)敏感現(xiàn)象。這可能是由于這類(lèi)菌株中耐藥基因大部分存在于染色體上，而導(dǎo)致其攜帶的耐藥基因以及耐藥性不容易隨著質(zhì)粒的消除而消除。

綜上所述，攜帶有耐藥I類(lèi)整合子大質(zhì)粒的印第安納沙門(mén)氏菌，更易從環(huán)境或其它細(xì)菌中獲得耐藥基因，是形成印第安納沙門(mén)氏菌耐藥克隆的主要原因。此質(zhì)粒是其在環(huán)境進(jìn)化過(guò)程中從其它腸桿菌科細(xì)菌獲得。通過(guò)質(zhì)粒消除及結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)一步證明這一點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：王天，徐紅紅，張林吉，等. 質(zhì)粒介導(dǎo)的印第安納沙門(mén)氏菌耐藥機(jī)制及分子溯源研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：619-625. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.076