張淼源，盧佩珊，李佳寧，李佳樂(lè)，鄭煒欣，歐陽(yáng)歲東

2019年底暴發(fā)的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，以下簡(jiǎn)稱(chēng)新冠病毒)引起的肺炎疫情，對(duì)我國(guó)乃至全球的公共衛(wèi)生體系、人民生命健康安全和國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展形成了巨大威脅。截至2021年11月1日，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)已在210多個(gè)國(guó)家或地區(qū)蔓延，全球累計(jì)新冠確診病例超過(guò)2.4億人，累計(jì)死亡病例達(dá)500萬(wàn)人[1]，國(guó)外新冠疫情的蔓延程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)內(nèi)，全球疫情防控形勢(shì)仍處于高度嚴(yán)控狀態(tài)，新冠肺炎防控形勢(shì)依舊十分嚴(yán)峻。早診斷、早隔離、早預(yù)防免疫仍是目前防控新冠病毒肺炎蔓延擴(kuò)散最有效的方法。因此，建立新冠病毒的快速、高效檢測(cè)的方法在新冠肺炎疫情防控方面具有極其重要的意義。

目前新冠病毒的檢測(cè)方法有抗原、抗體和核酸分子檢測(cè)方法[2-4]。其中熒光定量PCR技術(shù)是進(jìn)行分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而熒光定量PCR診斷耗時(shí)長(zhǎng)(一般需要4～5 h)、昂貴的反應(yīng)儀器以及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)操作人員等弊端限制了其應(yīng)用范圍。因此，亟需建立一種靈敏度高、操作方便、技術(shù)要求低的快速檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行及早檢測(cè)。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年英國(guó)TwistDx公司新開(kāi)發(fā)的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[5]，具有反應(yīng)時(shí)間短、可在 37～42 ℃的恒溫下實(shí)現(xiàn)對(duì)特定核酸序列的擴(kuò)增和退火、檢測(cè)結(jié)果易辨識(shí)等優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)儀器設(shè)備要求低，無(wú)需精密儀器即可完成反應(yīng)，近年來(lái)發(fā)展十分迅速，已被廣泛應(yīng)用于病原學(xué)檢測(cè)，公共食品安全等各個(gè)領(lǐng)域[6]。本研究擬根據(jù)編碼新冠蛋白N基因的保守序列設(shè)計(jì)新冠病毒RPA引物和探針，從而構(gòu)建一種新冠病毒的RPA-LFD檢測(cè)方法，并驗(yàn)證該方法的靈敏度、特異性，從而為建立一種高效簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)并適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的即時(shí)檢驗(yàn)(Point-of-Care Testing, POCT)技術(shù)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 含新冠病毒N基因的質(zhì)粒由山東大學(xué)高等研究所王培會(huì)教授惠贈(zèng)；電泳級(jí)瓊脂糖和DNA Ladder Marker購(gòu)自寶生物大連生物技術(shù)有限公司; 質(zhì)粒小提試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；TwistAmp○RBasic擴(kuò)增試劑盒，TwistAmp○Rnfo RPA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自英國(guó)TwistDx公司；Milenia Genline HybriDetect膠體金側(cè)向流動(dòng)試紙條購(gòu)自德國(guó)Milenia公司；流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒等核酸檢測(cè)參考品均來(lái)自廣東和信健康科技有限公司；PCR引物、RPA引物和探針由廣州艾基生物技術(shù)公司合成。使用儀器包括PCR反應(yīng)儀、水浴鍋、單道移液器、振蕩渦旋器、小型離心機(jī)。

1.2 病毒基因組的快速提取 參照快速核酸裂解液(通用型)(山東安普未來(lái)公司)的試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)中國(guó)疾病控制中心公布的新冠病毒N基因(Accession:: MT731346.1)的保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針，見(jiàn)表1。

1.4 引物的篩選和RPA反應(yīng)體系的確定 首先利用普通PCR方法鑒定3對(duì)PCR引物，引物序列如上所示，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min, 94 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、共32個(gè)循環(huán), 72 ℃ 10 min 延伸。

根據(jù)TwistAmp○RBasic擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RPA反應(yīng)。 RPA擴(kuò)增體系50 μL：將 RPA 上游引物2.4 μL(10 μmol/L)，RPA下游引物 2.4 μL(10 μmol/L)，ddH2O 11.2 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL 預(yù)混后轉(zhuǎn)入含有凍干酶制劑的 0.2 mL反應(yīng)管中，混勻后加入2 μL 100 ng新冠病毒質(zhì)粒模板及2.5 μL MgoAc (280 mmol/L)混勻并瞬離后置于39 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min用于擴(kuò)增靶基因，反應(yīng)后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，最后取10 μL純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)拍照。

最后根據(jù)TwistAmp○Rnfo RPA擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RPA-LFD反應(yīng)。RPA反應(yīng)在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min用于擴(kuò)增靶基因，然后取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋到裝有95 μL試紙條測(cè)試緩沖液EP管中進(jìn)行試紙條檢測(cè)， 觀察試紙條條帶出現(xiàn)后在5 min內(nèi)完成讀取。

1.5 敏感性實(shí)驗(yàn) 用含有新冠病毒N基因的質(zhì)粒作為RPA的標(biāo)準(zhǔn)品，以10倍的梯度稀釋?zhuān)尤塍w系以最優(yōu)反應(yīng)條件擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后用側(cè)流試紙檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證引物與探針的敏感性，質(zhì)粒的初始濃度為10 ng/反應(yīng)。

1.6 特異性實(shí)驗(yàn) 分別用流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒通過(guò)核酸快速釋放液裂解病毒，吸取同樣體積的裂解液，加入體系以最優(yōu)反應(yīng)條件擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后用側(cè)流試紙檢測(cè)，驗(yàn)證引物與探針的特異性。

2 結(jié) 果

2.1 RPA引物的篩選及RPA方法的驗(yàn)證 為了獲得特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效果好的RPA的引物，我們分析了不同新冠病毒株N基因的保守序列區(qū)域，我們?cè)O(shè)計(jì)了3對(duì)RPA引物，通過(guò)PCR方法對(duì)含有新冠病毒N基因的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示RPA-Primer1引物擴(kuò)增效果最好(圖1)。 進(jìn)而根據(jù)TwistAmp Basic試劑盒要求操作測(cè)試用RPA檢測(cè)新冠病毒核酸 (圖2)， 以試劑盒中提供的引物和陽(yáng)性樣品的RPA反應(yīng)作為參考顯示RPA反應(yīng)體系工作正常，我們用新冠病毒RPA-Primer1引物可以檢測(cè)到新冠病毒核酸的存在。因此，RPA-Primer1引物可以作為建立檢測(cè)新冠病毒側(cè)流層析試紙條的候選引物。

圖1 新冠病毒的RPA引物的篩選Fig.1 Screening of RPA primers for SARS-CoV-2

圖2 TwistAmp Basic試劑盒檢測(cè)新冠病毒核酸Fig.2 Detecting SARS-CoV-2 nucleic acid by TwistAmp Basis kits

2.2 RPA-LFD反應(yīng)條件優(yōu)化 根據(jù)RPA側(cè)流層析試紙檢測(cè)的要求，我們對(duì)RPA-Primer1引物進(jìn)行修飾，增加側(cè)流層析試紙檢測(cè)探針，按照TwistAmpTMnfo試劑盒的操作說(shuō)明建立新冠病毒核酸的RPA-LFD的檢測(cè)方法。為了獲得最佳的反應(yīng)條件，我們對(duì)RPA-LFD的反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行了測(cè)試(圖3A-B)， 結(jié)果顯示RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒核酸的最佳反應(yīng)溫度為37～40 ℃最佳的反應(yīng)時(shí)間是15～20 min，所以我們選擇建立的RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒核酸的最佳反應(yīng)體系為：反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖3 RP-LFD檢測(cè)新冠病毒核酸的反應(yīng)溫度(A)和時(shí)間(B)的選擇Fig.3 Temperture (A) and time (B) course of RPA-LFD assay for SARS-CoV-2 nucleic acid detection

2.3 靈敏度試驗(yàn) 分別選取系列稀釋度模板濃度進(jìn)行RPA-LFD擴(kuò)增，反應(yīng)在37 ℃，15 min后讀取 LFD結(jié)果，RPA-LFD反應(yīng)檢出新冠病毒核酸的極限可低至100 fg/反應(yīng)(圖4)。

圖4 RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒核酸的靈敏度Fig.4 Sensitivity test for SARS-CoV-2 nucleic acid detection by RPA-LFD assay

2.4 特異性試驗(yàn) 該反應(yīng)體系對(duì)新冠病毒、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示RPA-LFD只對(duì)新冠病毒有特異性反應(yīng)，而對(duì)流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)(圖5)。 該結(jié)果表明本方法可以特異性擴(kuò)增并檢測(cè)新冠病毒，具有良好的特異性。

圖5 RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒核酸的特異性Fig.5 Specificity test for SARS-CoV-2 nucleic acid detection by RPA-LFD assay

3 討 論

由新冠病毒引起的COVID-19已蔓延至全球幾乎所有國(guó)家和地區(qū)。 建立快速準(zhǔn)確的篩查對(duì)于控制SARS-CoV-2的持續(xù)傳播極為重要。 目前新冠病毒的篩查和診斷任務(wù)主要還依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室中的熒光定量PCR技術(shù)。然而這一技術(shù)依賴(lài)于貴重的儀器和專(zhuān)業(yè)人士的操作，對(duì)于基層醫(yī)院和廣大農(nóng)村地區(qū)檢測(cè)很難進(jìn)一步推廣。解決這種檢測(cè)困境的方法之一是開(kāi)發(fā)更人性化的檢測(cè)技術(shù)，且該技術(shù)可用于非專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境甚至家庭測(cè)試。通過(guò)采用LAMP等溫?cái)U(kuò)增方法與金標(biāo)準(zhǔn)RT-qPCR方法相比顯示出更多優(yōu)點(diǎn)，如儀器依賴(lài)性更低、速度更快、特異性更好。然而，在大多數(shù)這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)產(chǎn)物方式多樣化、操作簡(jiǎn)單，可為實(shí)現(xiàn)基層醫(yī)院和偏遠(yuǎn)地區(qū)的快速檢測(cè)。

本研究利用RPA技術(shù)，通過(guò)側(cè)流層析試紙條LFD建立的新冠病毒RPA-LFD檢測(cè)方法， 針對(duì)新冠病毒的保守序列設(shè)計(jì)了引物和探針，該方法的反應(yīng)體系最佳溫度為37 ℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為15 min，從反應(yīng)開(kāi)始，可在5 min后用 LFD檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，該檢測(cè)方法可以直接讀取結(jié)果，不需要電泳儀，特異性強(qiáng)，對(duì)流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒等呼吸系統(tǒng)感染性病毒均沒(méi)有交叉反應(yīng)；靈敏度高，檢測(cè)限低至100 fg/反應(yīng)。同時(shí)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)耗時(shí)短，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)診斷方面具有顯著的優(yōu)越性。目前國(guó)際上也已有相關(guān)基于RPA技術(shù)檢測(cè)新冠病毒的報(bào)道[7-10]，但本研究建立的新冠病毒RPA-LFD的檢測(cè)方法因?yàn)?7 ℃的最佳反應(yīng)溫度可更適合為新冠病毒肺炎現(xiàn)場(chǎng)快速診斷及防控提供技術(shù)參考。盡管如此，RPA-LFD方法仍然存在一些缺點(diǎn)，需要不斷改進(jìn)，例如RPA引物探針本身存在著 “噪音”現(xiàn)象，即隨著時(shí)間的推移，陰性對(duì)照可能會(huì)在試紙條上慢慢出現(xiàn)輕微的檢測(cè)線(xiàn)。 目前本研究采用控制LFD結(jié)果讀取時(shí)間(5 min以?xún)?nèi))， 使用Image J對(duì)檢測(cè)線(xiàn)進(jìn)行灰度分析，提高結(jié)果判定的客觀性。由于新冠病毒臨床樣品目前基于各種條件難以采集，因此我們沒(méi)有開(kāi)展RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒快速診斷方法在臨床上的樣品驗(yàn)證。在以后收集新冠臨床樣品后，我們將進(jìn)一步完善建立RPA-LFD檢測(cè)新冠病毒方法。

綜上所述，本研究建立的新冠病毒核酸RPA-LFD檢測(cè)方法具有較高的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)便，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。該方法具有在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)大規(guī)模檢測(cè)使用的潛力。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張淼源，盧佩珊，李佳寧，等. 重組酶聚合酶?jìng)?cè)流層析技術(shù)檢測(cè)新冠病毒核酸快速診斷方法的初步建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：577-581. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.077