趙 洲，劉景輝 ，薩如拉，周玉雷

(1.赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古赤峰 024000;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

燕麥(L.,2n=6x=42) 屬禾本科一年生草本植物，是全球種植的第六大禾谷類作物。其籽粒富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、可溶性膳食纖維、B族維生素、β-葡聚糖以及燕麥蒽酰胺(avenanthramides，AVAs)等，在抗炎、抗增生、治療糖尿病以及心血管治療方面都有特殊療效，是優(yōu)良保健食品。燕麥具有很好的耐鹽堿特性，是改良鹽堿化土壤的優(yōu)良作物。

鹽堿脅迫會(huì)抑制作物的生長(zhǎng)、發(fā)育，最終影響作物產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿對(duì)水稻穗部性狀(穗長(zhǎng)、穗重、穗粒數(shù)、籽粒飽滿度等)及灌漿的脅迫程度與鹽堿濃度密切相關(guān)；品種間存在明顯差異，輕度鹽堿脅迫可促進(jìn)抗性品種提高結(jié)實(shí)率，卻明顯抑制敏感品種。鹽堿脅迫對(duì)燕麥的產(chǎn)量和籽粒品質(zhì)有明顯的抑制效應(yīng)，抑制程度因品種而異；隨著鹽堿脅迫加重，燕麥產(chǎn)量呈遞減趨勢(shì)，主要因?yàn)榍ЯＶ嘏c穗粒數(shù)的降低。鹽堿脅迫對(duì)燕麥籽粒成分的影響存在品種間差異。在遭受逆境脅迫過(guò)程中，穗在協(xié)調(diào)組織的抗逆過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在干旱脅迫下，抗旱小麥品種穗中苯丙烷類代謝途徑加強(qiáng)，能維持很好的細(xì)胞膜完整性并保持足夠的水分；鹽堿脅迫下水稻穗中的部分蛋白上調(diào)表達(dá)，如：滲透調(diào)節(jié)蛋白、抗逆相關(guān)蛋白、促進(jìn)RNA穩(wěn)定及蛋白合成類蛋白、WD-repeat信號(hào)類蛋白、Nucleoside diphosphate kinase(NDPK)、參與脂肪酸合成的enoyl-ACP reductase(ENR)、ATP合成以及ROS清除類蛋白等。有關(guān)燕麥穗的抗鹽堿機(jī)理研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在燕麥抽穗期進(jìn)行短期堿脅迫處理，運(yùn)用Label Free蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)穗組織開(kāi)展相關(guān)研究，以期明確堿脅迫下燕麥穗組織在蛋白水平上的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料種植及處理

以耐鹽堿品種 Vao-9(父母本為99VB-84-1和99VB-22-2)以及鹽堿敏感品種 Xin-17作為材料。挑選完整、大小均勻的種子，于0.1% HgCl中消毒8 min，無(wú)菌蒸餾水清洗3次，自然晾干。種植于盛滿蛭石的盆中(直徑25 cm,高30 cm)，溫室定期澆灌Hoagland溶液及蒸餾水。

抽穗期(約50%植株抽穗)進(jìn)行鹽堿脅迫處理。堿性鹽 NaHCO和NaCO按等摩爾比混合，設(shè)置2個(gè)濃度處理，分別為0 mmol·L(對(duì)照，pH 7.0)和100 mmol·L(pH 9.82),重復(fù)3次。處理6 d后，采集不同處理的穗,進(jìn)行Label Free 蛋白組分析。

1.2 蛋白提取及分析

取1.1中采集的穗適量在液氮中充分磨碎，加入5倍體積的TCA/丙酮(1∶9)，置于-20 ℃沉淀，4 ℃、6 000 r·min離心1 h，收集沉淀；用預(yù)冷丙酮洗滌3次，干燥沉淀。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。并通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

按被測(cè)蛋白量的 1/50的比例加入胰蛋白酶，37 ℃過(guò)夜消化；12 000 ×g 離心 20 min，收集肽段沉淀。采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行蛋白分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，經(jīng)過(guò)分析柱分離，流速為300 nL·min。

1.3 蛋白質(zhì)譜鑒定及分析

樣品經(jīng)色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)為120 min ，檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m·z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000(200 m·z)，AGC(Automatic gain control)設(shè)為1e6，Maximum IT設(shè)為50 ms，Dynamic exclusion 設(shè)定為60.0 s。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)采用MaxQuant軟件(版本號(hào)1.5.3.17)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。蛋白及肽段False discovery rate(FDR)小于等于0.01。表達(dá)差異倍數(shù)大于 2.0 (上、下調(diào))且value 小于 0.05的蛋白質(zhì)視為差異表達(dá)蛋白質(zhì)(different expressed proteins，DEPs)。

1.4 蛋白功能注釋、富集及聚類分析

利用序列比對(duì)工具NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO(gene ontology)注釋。為提高注釋效率，通過(guò)InterProScan搜索EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與目標(biāo)蛋白質(zhì)匹配的保守基序，并將相關(guān)的功能信息注釋給目標(biāo)蛋白質(zhì)序列；運(yùn)行ANNEX對(duì)注釋信息進(jìn)一步補(bǔ)充，并在不同的GO類別之間建立聯(lián)系，以提高注釋的準(zhǔn)確性。

在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server) 軟件，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋,將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行KO(KEGG Ontology)歸類，并根據(jù)KO歸類自動(dòng)獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。

在對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋或KEGG通路注釋的富集分析時(shí)，通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)，比較各個(gè)GO分類或KEGG通路在目標(biāo)蛋白質(zhì)集合和總體蛋白質(zhì)集合中的分布情況，評(píng)價(jià)某個(gè)GO term或KEGG通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平。

對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理[歸一化到(-1,1)區(qū)間]。使用Cluster 3.0軟件同時(shí)對(duì)樣品和蛋白質(zhì)的表達(dá)量?jī)蓚€(gè)維度進(jìn)行分類。使用Java Treeview軟件生成層次聚類 熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響

堿脅迫6 d后，抗性品種Vao-9的脅迫組(Vao-9T)與對(duì)照組(Vao-9CK)之間表型沒(méi)有差異。而敏感品種Xin-17的處理組(Xin-17T)較對(duì)照組(Xin-17CK)株高明顯變矮，老葉開(kāi)始黃化并出現(xiàn)萎蔫，且穗長(zhǎng)明顯較短，小穗數(shù)明顯減少。Vao-9T與Vao-9CK間穗含水量沒(méi)有顯著差異；Xin-17T較Xin-17CK的穗含水量顯著降低(<0.01)(圖1)。這說(shuō)明堿脅迫對(duì)燕麥鹽堿敏感品種生長(zhǎng)有明顯抑制作用，對(duì)抗鹽堿品種影響較小。

2.2 堿脅迫對(duì)燕麥穗組織蛋白組分的影響

經(jīng)過(guò)分離、鑒定，在Vao-9CK中獲得60 446個(gè)肽譜圖，Vao-9T中獲得61 883個(gè)肽譜圖，對(duì)其分別鑒定得到2 682、2 806個(gè)蛋白；在Xin-17CK及Xin-17T中分別獲得10 320、9 933個(gè)肽譜圖，最終分別獲得2 783、2 753個(gè)蛋白；四個(gè)處理組中檢測(cè)得到2 306個(gè)相同蛋白(圖2)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Vao-9T與Vao-9CK比較，共發(fā)現(xiàn)50個(gè)差異表達(dá)蛋白28個(gè)上調(diào)表達(dá)，22個(gè)下調(diào)表達(dá)；Xin-17T與Xin-17CK比較，有24個(gè)差異表達(dá)蛋白上調(diào)表達(dá)，22個(gè)下調(diào)表達(dá)；Xin-17T與Vao-9T比較，發(fā)現(xiàn)82個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中41個(gè)上調(diào)表達(dá)，41個(gè)下調(diào)表達(dá)(表1)。

表1 上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的差異蛋白數(shù)Table 1 Number of up-and down-regulated DEPs

Vao-9T：Vao-9堿脅迫;Vao-9CK：Vao-9對(duì)照；Xin-17T：Xin-17堿脅迫；Xin-17CK：Xin-17對(duì)照。下同。圖柱上不同字母表示差異顯著(P≤0.01)。

圖2 不同處理中獲得蛋白的Venn圖Fig.2 Venn figure of proteins under different treatments

2.3 差異表達(dá)蛋白GO和KEGG富集分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種間堿處理組與其對(duì)照中出現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白類型明顯不同。在抗性品種Vao-9中，發(fā)生差異表達(dá)的蛋白主要是DNA聚合酶組分蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子組分蛋白(圖3)，其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能主要與抗逆、DNA修復(fù)、多糖代謝、乙醇合成等有關(guān)；在敏感品種Xin-17中，發(fā)生差異表達(dá)的蛋白主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分、細(xì)胞骨架組分以及膜結(jié)構(gòu)組分有關(guān)(圖4)，其主要與糖代謝有關(guān)。這說(shuō)明對(duì)于堿脅迫，抗性品種的穗組織表現(xiàn)為主動(dòng)抵御，而敏感品種的穗組織則表現(xiàn)為被動(dòng)的能量消耗。

富集條目為top 10條目；柱形圖右側(cè)值分別為P值和富集指數(shù)；P:生物過(guò)程；F:分子功能；C:細(xì)胞成分。下同。

圖4 Xin-17T/Xin-17CK處理組GO富集分析Fig.4 GO enrichment in Xin-17T/Xin-17CK treatment group

進(jìn)一步的KEGG富集分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照條件下，兩個(gè)品種之間幾乎沒(méi)有富集到差異表達(dá)途徑，而堿脅迫后，二者出現(xiàn)較多的差異表達(dá)途徑，主要包括信號(hào)感應(yīng)及傳遞(Quorum sensing、MAPK signaling pathway-plant)、甘油脂類代謝、鞘糖脂合成、賴氨酸降解、細(xì)胞周期、半乳糖代謝、核苷酸切除修復(fù)、吲哚堿合成等。通過(guò)富集分析，兩個(gè)品種中均發(fā)現(xiàn)大量的“黃酮、類黃酮合成途徑”相關(guān)蛋白；敏感品種的差異蛋白多分布于“纈氨酸-亮氨酸異亮氨酸降解途徑”，而抗性品種的差異蛋白多集中在“核苷酸切除修復(fù)途徑”。

圖5 KEGG代謝途徑富集分析Fig.5 KEGG enrichment of metabolism pathway

對(duì)Vao-9T、Vao-9CK及Xin-17T、Xin-17CK兩個(gè)處理組中獲得的主要差異蛋白進(jìn)一步分析顯示，這些差異蛋白功能集中在蛋白合成以及加工、光合作用、糖代謝、次生代謝、細(xì)胞組分合成、信號(hào)傳遞以及抗逆過(guò)程(圖6-7，表2-3)。

圖6 Vao-9T/Vao-9CK處理組差異蛋白熱圖Fig.6 Vao-9T/Vao-9CK treatment group heat map

在這些蛋白中，核糖體組分I1H5D5及與信號(hào)、抗逆相關(guān)的I1HPB2、Q40237、Q9M4C7，在兩個(gè)品種中都下調(diào)表達(dá)。參與次生代謝合成過(guò)程的Q9ZTU0(Caffeic acid O-methyltransferase)在抗性品種Vao-9中上調(diào)表達(dá)3.0倍，而在敏感品種Xin-17中則下調(diào)表達(dá)0.5倍(表2-3)；同樣，其他參與次生代謝的差異蛋白在Vao-9中均上調(diào)表達(dá)(W5D5N4，F(xiàn)2D5L5)，而在Xin-17中則下調(diào)表達(dá)(I1IBR5，I1IV07)(表2-3)。I1HWE6(UTP--glucose-1-phosphate uridylyltransferase)參與UDP-葡萄糖代謝過(guò)程，在Xin-17中上調(diào)表達(dá)2.2倍，而在Vao-9中則下調(diào)表達(dá)0.4倍；其他參與糖代謝的多個(gè)蛋白在Xin-17中也發(fā)生上調(diào)表達(dá)，而在Vao-9中則沒(méi)有差異表達(dá)。

圖7 Xin-17T/Xin-17CK處理組差異蛋白熱圖Fig.7 Xin-17T/Xin-17CK treatment group heat map

表2 Vao-9T/Vao-9CK處理組主要差異蛋白分析Table 2 Main DEPs in Vao-9T/Vao-9CK treatment group

3 討 論

在鹽堿脅迫下，植物糖代謝途徑是最容易受到影響的代謝途徑之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫下，燕麥葉片糖代謝途徑中出現(xiàn)大量的差異表達(dá)蛋白；抗性品種燕麥Vao-9遭受鹽脅迫后，不少糖代謝相關(guān)的酶出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；在堿脅迫下，抗性品種燕麥Vao-9根部不少糖代謝途徑相關(guān)的蛋白都下調(diào)表達(dá)，而地上組織中相關(guān)酶類卻出現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫處理6 d后，兩個(gè)品種穗組織中糖代謝出現(xiàn)大量的差異表達(dá)蛋白，特別是在Xin-17中更為明顯，這與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。同時(shí)，兩個(gè)不同抗性品種中糖代謝相關(guān)的差異蛋白也表現(xiàn)出明顯的差異，表現(xiàn)為：抗性品種中差異表達(dá)蛋白相對(duì)較少，且以下調(diào)表達(dá)為主(表2)，而在敏感品種Xin-17中，則出現(xiàn)較多的差異表達(dá)蛋白，且多數(shù)為顯著上調(diào)表達(dá)(表3)，如：參與多糖水解的酶Q42518、N1NSX3、N1NUT2、N1NV60，參與生物能量轉(zhuǎn)化的A0A1D6D1Q3、I1HWE6等，這些蛋白含量增加有助于增強(qiáng)燕麥的抗逆，同時(shí)也說(shuō)明敏感品種Xin-17對(duì)堿脅迫的反應(yīng)主要是一個(gè)消耗能量、被動(dòng)抵御的過(guò)程，這與抗性品種Vao-9的表現(xiàn)截然相反。

表3 Xin-17T/Xin-17CK處理組主要差異蛋白分析Table 3 Main DEPs in Xin-17T/Xin-17CK treatment group

在鹽堿脅迫下，蛋白合成、加工等過(guò)程也是容易遭受影響的重要代謝過(guò)程。在不少植物的相關(guān)研究中，均發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象，如：在堿脅迫下，小麥老葉中大量的核糖體組分蛋白顯著下調(diào)表達(dá)，而蛋白酶和核糖核酸酶卻顯著上升表達(dá)；短期堿脅迫后，抗性品種燕麥Vao-9幼苗根中不少核糖體組分蛋白上調(diào)表達(dá)，而地上部分沒(méi)有檢測(cè)到明顯的變化。在本研究中，比較抗性品種與敏感品種的穗組織中蛋白在短期的堿脅迫后變化，發(fā)現(xiàn)在抗性品種Vao-9穗中，出現(xiàn)很多差異表達(dá)蛋白參與蛋白質(zhì)合成及加工過(guò)程，其中不少出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，包括核糖體組分(A0A0Q3JFN1)及蛋白修飾加工相關(guān)蛋白(F2DWA3、M7Z458、I1HVG4)；而在敏感品種Xin-17的穗組織中，只檢測(cè)到一個(gè)差異核糖體組分蛋白，且為下調(diào)表達(dá)(I1H5D5)。這進(jìn)一步顯示兩個(gè)品種在抗堿脅迫過(guò)程中的明顯差異，前者為積極的抵御，后者表現(xiàn)為被動(dòng)消耗。

研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫過(guò)程中，谷胱甘肽代謝途徑中的一些酶類參與抗逆過(guò)程。同時(shí)，在堿脅迫下燕麥中檢測(cè)到大量抗逆相關(guān)的蛋白，如：次生代謝物合成相關(guān)蛋白、PRs蛋白等。本試驗(yàn)中，鹽堿脅迫下，抗性品種Vao-9穗中次生代謝合成酶類顯著上調(diào)表達(dá)(W5D5N4、F2D5L5、Q9ZTU0)而敏感品種Xin-17中則顯著下調(diào)表達(dá)(I1IBR5、Q9ZTU0)；其次Vao-9穗中的谷胱甘肽代謝過(guò)程的幾個(gè)酶類也顯著上調(diào)表達(dá)(I1HUX2、K7AFN0)，而敏感品種Xin-17中卻未檢測(cè)到；敏感品種中兩個(gè)PRs類抗逆蛋白(P50697、M5AKY4)顯著上調(diào)表達(dá)，這也是兩個(gè)品種之間的主要差異。這些差異表達(dá)蛋白可用于區(qū)分與篩選燕麥抗逆與敏感品種。

利用蛋白組學(xué)技術(shù)開(kāi)展非模式生物的抗逆脅迫過(guò)程研究，具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，能從復(fù)雜的宏觀水平對(duì)參與數(shù)個(gè)代謝途徑的大量蛋白開(kāi)展定性、定量研究。由于目前的一些技術(shù)問(wèn)題、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)更新問(wèn)題，也會(huì)導(dǎo)致不少冗余數(shù)據(jù)的產(chǎn)生。而利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究燕麥響應(yīng)鹽堿脅迫的機(jī)制、篩選抗性燕麥品種有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。本研究中，在遭受堿短期脅迫后，燕麥敏感品種與抗性品種穗組織中均出現(xiàn)大量的差異表達(dá)蛋白參與到次生代謝過(guò)程中，如：黃酮、類黃酮的合成等；二者間也表現(xiàn)出明顯的差異，特別是在糖代謝過(guò)程、蛋白合成過(guò)程以及抗逆等。在堿脅迫下，抗性品種穗組織中與蛋白合成有關(guān)過(guò)程加強(qiáng)，而敏感品種則為多糖類的降解、能量的消耗；抗性品種通過(guò)增加次生代謝、谷胱甘肽代謝等抵御脅迫，而敏感品種則表現(xiàn)為PRs類蛋白的大量合成。