高 聰，李紫良，胡 甘，張建朝，馮小雨，牛 娜，宋瑜龍，馬守才，劉東濤，王軍衛(wèi)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221131)

近幾十年來，雜種優(yōu)勢利用在玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)和油菜(BrassicanapusL.)生產(chǎn)上已取得了舉世矚目的成就[1-3]，而雜交小麥卻一直未能取得重要突破。小麥?zhǔn)侨澜缰饕Z食作物之一，是全球約30%人口的主要食物來源。全球人口的持續(xù)增長以及人們生活質(zhì)量的提高，對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的要求也隨之提高。從目前來看，創(chuàng)制雜交小麥仍然是提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)最有效的途徑之一，并且對世界糧食生產(chǎn)和安全具有舉足輕重的影響[4]。

小麥?zhǔn)菄?yán)格的自花授粉作物，小麥雜種優(yōu)勢的利用嚴(yán)格依賴于小麥雄性不育系的選育。但是目前采用的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、光溫敏雄性不育系以及化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的生理型雄性不育系分別存在不育恢復(fù)機(jī)理復(fù)雜、對環(huán)境因素影響敏感以及化學(xué)雜交劑藥效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，不能滿足小麥生產(chǎn)發(fā)展的需要[5-7]。與其他方法相比，由核不育控制的“二系”雜種優(yōu)勢利用技術(shù)，能夠克服了細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系法和光溫敏雄性不育兩系法的缺陷，且兼具細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系法的穩(wěn)定性和光溫敏雄性不育兩系法配組靈活性的優(yōu)點(diǎn)，具有重要的市場利用價值[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的核不育基因有ms1、ms5、Ms2、Ms3和Ms4，其中ms1和ms5是隱性突變體，Ms2、Ms3和Ms4是顯性突變體[9-13]。然而，利用常規(guī)的育種方法很難將植物的隱性不育基因有效地保持和利用起來。因此，培育不受環(huán)境影響且可自主保持、繁殖的單隱性核不育系已成為雄性不育系選育技術(shù)的難點(diǎn)。

2017年，第一個隱性核不育基因ms1被克隆，其等位恢復(fù)基因Ms1基因只在禾本科植物的小孢子和花藥中表達(dá)，該基因突變導(dǎo)致花藥中長鏈脂肪酸積累和花粉外壁結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而引起花粉敗育[14]。該基因的克隆為通過基因工程創(chuàng)制雄性不育系和規(guī)?；苽潆s交小麥種子提供了可能。近年來，美國杜邦公司開發(fā)了SPT技術(shù)，通過利用隱性核不育基因ms45，實(shí)現(xiàn)了玉米雄性不育的保持和雜種優(yōu)勢利用[15]。SPT技術(shù)是指將育性恢復(fù)基因Ms45、花藥特異性表達(dá)啟動子PG47、玉米α淀粉酶基因ZmAA1、紅色熒光蛋白基因DsRed2及特異性啟動子和終止子序列一起連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到Ms45基因突變 (ms45/ms45)導(dǎo)致的核不育玉米中，T1代中基因型為Ms45-ZmAA1-DsRed2/ms45。由于α淀粉酶基因ZmAA1的表達(dá)導(dǎo)致攜帶Ms45-ZmAA1-DsRed2的花粉致死，T1代自交時只能產(chǎn)生基因型ms45的花粉，產(chǎn)生的種子基因型為帶轉(zhuǎn)基因的Ms45-ZmAA1-DsRed2/ms45和不帶轉(zhuǎn)基因ms45/ms45，2種基因型各占50%，通過觀察紅色熒光區(qū)分2種種子。這樣生產(chǎn)的不育系 (ms45/ms45)能夠保持且不攜帶轉(zhuǎn)基因，保持系(Ms45-ZmAA1-DsRed2/ms45)則能夠自我繁殖。Chang等[16]發(fā)現(xiàn)，水稻OsNP1的突變會產(chǎn)生雄性不育的隱性核不育OsNP1基因，并利用該基因并結(jié)合SPT技術(shù)，開展了水稻的雜種優(yōu)勢利用工作。

本試驗(yàn)以SPT技術(shù)為依托，利用表達(dá)載體pGEII能夠攜帶較大的外源目的基因且可在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)的特性，通過無縫克隆技術(shù)和同源重組酶，將花粉致死基因ZmAA1、小麥花粉育性恢復(fù)基因Ms1、紅色熒光蛋白基因DsRed2及其特異性啟動子和終止子序列構(gòu)建植物表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2，并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建是否成功，以期為創(chuàng)制可以保持和繁殖的新型不育系材料，規(guī)避育種中轉(zhuǎn)基因生物安全問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種中國春、植物表達(dá)載體pGEII和農(nóng)桿菌菌株GV3101均由西北農(nóng)林科技大學(xué)作物雜種優(yōu)勢研究與利用課題組提供，pGEII攜帶有草銨膦抗性，玉米自交系B73為西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院郭東偉副教授惠贈，載體pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉文國研究員惠贈。

1.2 DNA、總RNA的提取與cDNA的合成

將小麥品種中國春在人工氣候室(溫度10 ℃，相對濕度50%，光照/黑暗16 h/8 h，光照強(qiáng)度18 000 lx)培養(yǎng)至減數(shù)分裂期，取幼穗使用TRNzol-A+試劑盒(天根，北京)提取總RNA，取葉片使用CTAB法提取DNA[17]。將玉米自交系B73種子在人工氣候室(條件同上)培養(yǎng)，萌發(fā)3 d時取胚乳使用TransZol Plant試劑盒(全式金，北京)提取總RNA，植株生長2周時取葉片提取DNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，北京)將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3 隱性核不育恢復(fù)基因 Ms1表達(dá)盒pGEM3ZEVL-Ms1的構(gòu)建

以Ms1-P-F/R為引物(表1)，以中國春DNA為模板，擴(kuò)增育性恢復(fù)基因Ms1的啟動子，暫命名為Ms1-P(GenBank No.MG273685.1)；以Ms1-F/R為引物(表1)，以中國春cDNA為模板，擴(kuò)增Ms1基因的編碼區(qū)序列(GenBank No.MG273685.1)[14]；以F8-1-F/R為引物(表1)，以中國春DNA為模板，擴(kuò)增小麥花粉特異表達(dá)基因F8-1的終止子(GenBank No.KP878480.1)[18]。以上序列擴(kuò)增均使用KOD-Plus-Neo高保真酶(TOYOBO，日本)進(jìn)行。隨后，使用內(nèi)切酶EcoR V酶切pGEM3ZEVL載體。使用BM無縫克隆試劑盒(博邁德，北京)將擴(kuò)增得到的Ms1和F8-1終止子連接到線性化pGEM3ZEVL載體上，構(gòu)建重組載體。以此載體為模板，使用引物MF-F/R(表1)擴(kuò)增得到帶有同源序列的Ms1-F8-1片段。使用BM無縫克隆試劑盒將Ms1-P和Ms1-F8-1連接，構(gòu)建pGEM3ZEVL-Ms1載體，完成核不育恢復(fù)基因Ms1表達(dá)盒的構(gòu)建。

1.4 花粉致死基因表達(dá)盒pGEII-ZmAA1-DsRed2的構(gòu)建

以PG47-F/R為引物(表1)，以玉米自交系B73的DNA為模板，擴(kuò)增啟動子PG47(GenBank No.X66692.1)；以ZmAA1-F/R為引物(表1)，以玉米自交系B73的 cDNA為模板，擴(kuò)增花粉致死基因ZmAA1的編碼區(qū)序列(GenBank No.NM_001176140.1)；以IN2-1-F/R為引物(表1)，以玉米自交系B73的DNA為模板，擴(kuò)增終止子IN2-1(GenBank No.BT040284.1)；以引物DsRed2-F/R為引物(表1)，以載體pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2為模板，擴(kuò)增DsRed2-box，包含啟動子Ltp2(GenBank No.X69793.1)、DsRed2(GenBank No.KY379159.1)、NOS終止子。以上序列擴(kuò)增均使用KOD-Plus-Neo高保真酶進(jìn)行。用BM無縫克隆試劑盒將ZmAA1和IN2-1連接到線性化pGEM3ZEVL載體上，得到重組載體pGEM3ZEVL-ZmAA1-IN2-1。以此重組載體為模板，用引物ZmAA1-F/R-1(表1)擴(kuò)增得到ZmAA1-IN2-1片段。用BM無縫克隆試劑盒將ZmAA1-IN2-1和DsRed2-box連接到pGEM3ZEVL載體，得到重組載體pGEM3ZEVL-ZmAA1-IN2-1-DsRed2-box。隨后以此重組載體為模板，用引物ZID-F/R(表1)擴(kuò)增得到帶有同源序列的ZmAA1-IN2-1-DsRed2-box，用EcoR I和XhoI雙酶切pGEII載體，將啟動子PG47和ZmAA1-IN2-1-DsRed2-box連接到表達(dá)載體pGEII上，得到重組載體pGEII-ZmAA1-DsRed2，完成花粉致死基因ZmAA1表達(dá)盒的構(gòu)建，其中包含紅色熒光蛋白基因DsRed2。

1.5 小麥隱性核不育保持系表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2的構(gòu)建

以構(gòu)建的Ms1表達(dá)盒pGEM3ZEVL-Ms1載體為模板，用引物Ms1-F1/R1擴(kuò)增得到帶有同源序列的MS1-P-Ms1-F8-1片段。用EcoR I酶切pGEII-ZmAA1-DsRed2載體，隨后通過BM無縫克隆試劑盒將MS1-P-Ms1-F8-1連接到線性化pGEII-ZmAA1-DsReds載體上，得到重組表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2，完成小麥隱性核不育保持系表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.6 pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法[19]，將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中。培養(yǎng)成熟后，收獲T0代種子并繼續(xù)種植，待發(fā)芽一周后，噴灑5 mg·L-1的除草劑草銨膦進(jìn)行抗性篩選，生長7 d左右后，除去萎蔫、枯死以及生長緩慢的植株，將抗性植株繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T1代種子。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測及種子熒光觀察

提取T1代抗性植株的葉片DNA，設(shè)計引物ZmAA1-F2/R2(表1)對抗除草劑 T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。以pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2載體作為陽性對照，野生型擬南芥葉片DNA作為陰性對照，以提取的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR檢測。使用德國ZEISS生物熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因種子的紅色熒光。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 隱性核不育恢復(fù)基因 Ms1表達(dá)盒pGEM3ZEVL- Ms1的構(gòu)建結(jié)果

以Ms1-P-F/R、F8-1-F/R為引物，以中國春DNA為模板，擴(kuò)增隱性核不育基因Ms1的啟動子Ms1-P(圖1A)和小麥花粉特異表達(dá)基因F8-1終止子，分別得到2 670和245 bp的特異條帶(圖1C)；以Ms1-F/R為引物，以中國春cDNA為模板，擴(kuò)增育性恢復(fù)基因Ms1，得到663 bp的特異條帶(圖1B)。使用BM無縫克隆試劑盒先把育性恢復(fù)基因Ms1和F8-1終止子連接起來，然后將MS1-P與Ms1-F8-1連接在一起，經(jīng)測序驗(yàn)證與目的序列一致，得到隱性核恢復(fù)基因Ms1表達(dá)盒pGEM3ZEVL-Ms1。

2.2 花粉致死基因表達(dá)盒pGEII-ZmAA1-DsRed2的構(gòu)建結(jié)果

分別以PG47-P-F/R和IN2-1-F/R為引物，以玉米B73的DNA為模板，分別擴(kuò)增啟動子PG47和終止子IN2-1，分別得到2 873和344 bp的特異條帶(圖2A)；以ZmAA1-F/R為引物，以玉米B73的cDNA為模板，擴(kuò)增花粉致死基因ZmAA1，得到1 346 bp的特異條帶(圖2A)；以DsRed2-F/R為引物，以載體pCAMBIA3300-Ltp2-DsRed2為模板，擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因DsRed2-box，得到2 153 bp的特異條帶(圖2B)。用BM無縫克隆試劑盒先把ZmAA1基因和IN2-1終止子連接起來，隨后把ZmAA1-IN2-1與DsRed2-box連接在一起。用EcoR I和XhoI雙酶切pGEII載體，把PG47啟動子和ZmAA1-IN2-1-DsRed2連接到表達(dá)載體上，得到花粉致死基因ZmAA1表達(dá)盒重組載體pGEII-ZmAA1-DsRed2。

M1:DL5000。圖2和圖3同。M2:DL2000。圖5同。

圖2 啟動子 PG47、玉米花粉致死基因 ZmAA1、終止子 IN2-1和紅色熒光蛋白基因 DsRed2-box的克隆結(jié)果Fig.2 Cloning results of PG47 promoter,maize anther lethal gene ZmAA1,IN2-1 terminator and DsRed2-box

2.3 小麥隱性核不育保持系表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2的構(gòu)建結(jié)果

以構(gòu)建的Ms1表達(dá)盒pGEM3ZEVL-Ms1載體為模板，用引物Ms1-F1/R1擴(kuò)增得到帶有同源序列的Ms1-P-Ms1-F8-1。用EcoR I酶切pGEII-ZmAA1-DsRed2載體，隨后通過BM無縫克隆試劑盒將Ms1-P-Ms1-F8-1連接到線性化載體上，得到重組表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2。用AscI和XhoI對重組載體進(jìn)行雙酶切鑒定，這兩種酶的酶切位點(diǎn)在載體中都是唯一的，酶切后得到一條3 814 bp的條帶(圖3)，與目標(biāo)條帶一致。經(jīng)測序驗(yàn)證，重組載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2與目的序列一致，完成了小麥隱性核不育保持系表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2的構(gòu)建(圖4)。

1：用Asc I和Xho I對重組載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2的雙酶切結(jié)果。

圖4 pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2的載體圖譜Fig.4 Map of pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2 vector

2.4 pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

將重組質(zhì)粒pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。經(jīng)過除草劑草銨膦篩選，發(fā)現(xiàn)有9株T1代抗性擬南芥成活。提取T1代抗性擬南芥葉片DNA，用目的基因ZmAA1的特異引物ZmAA1-F2/R2進(jìn)行PCR檢測，以野生型擬南芥DNA為陰性對照，以重組質(zhì)粒pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2為陽性對照。經(jīng)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有6株抗性擬南芥的DNA能夠擴(kuò)增出目的條帶(圖5)，說明T1代共獲得6株轉(zhuǎn)基因陽性擬 南芥。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的鑒定結(jié)果

使用熒光顯微鏡在紅色熒光濾光片下觀察野生型擬南芥種子和T1代轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥種子，發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥的種子表面平滑，不能發(fā)出紅色熒光信號；而轉(zhuǎn)基因種子表面呈顆粒狀，會發(fā)出紅色熒光信號(圖6)，說明紅色熒光蛋白基因DsRed2在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中得到表達(dá)。

3 討 論

雜種優(yōu)勢利用是提高小麥產(chǎn)量和品質(zhì)最有效的途徑之一，對世界的糧食安全保障具有重要的意義[20]。盡管目前利用三系、光溫敏和化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的雜交種已在生產(chǎn)上得到應(yīng)用，但是由于制種復(fù)雜、不育系不穩(wěn)定以及藥劑殘留等問題，導(dǎo)致制種成本高，質(zhì)量難以保障[15]。因此，需要采用新的途徑，來提高雜交小麥種子質(zhì)量以及降低制種成本，并且能夠快速選育雜交種，這是目前小麥生產(chǎn)上急需解決的問題?，F(xiàn)有的藍(lán)標(biāo)型隱性核不育雜交小麥生產(chǎn)技術(shù)體系雖然可以通過顏色分辨不育系種子(白色)和保持系種子(淺藍(lán)色)，但是同時也產(chǎn)生了純合育性正常的深藍(lán)粒種子，而目前的色選機(jī)僅能夠做到區(qū)分藍(lán)、白粒，不能區(qū)分淺藍(lán)、深藍(lán)粒，這就造成了隨著繁殖年代的增加，不育系的繁殖效率顯著下降[21]。SPT技術(shù)的發(fā)明，建立了一種新型雜交種子生產(chǎn)技術(shù)體系，通過基因工程獲得的隱性核不育保持系自交產(chǎn)生的種子中，50%是不帶熒光的不育系種子，50%是帶熒光的保持系種子，采用色選技術(shù)很容易區(qū)分保持系與不育系種子，并且不育系種子中不含轉(zhuǎn)基因成分。因此，利用該體系不僅可以提高制種純度、降低制種成本，而且生產(chǎn)的不育系種子中不含外源基因，確保了生物安全[22]。這就避免了藍(lán)標(biāo)型隱性核不育雜交小麥生產(chǎn)技術(shù)體系深藍(lán)粒篩選產(chǎn)生的問題。Chang等[16]利用SPT技術(shù)，將 1 200份水稻恢復(fù)系和不育系雜交，發(fā)現(xiàn)約85%的F1植株單株產(chǎn)量優(yōu)于親本，表明該技術(shù)在水稻的雜交育種和生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

A:野生型擬南芥種子；B～D:轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。比例尺=0.2 mm。

1～3：轉(zhuǎn)基因擬南芥；4：陰性對照；5：陽性對照。

本研究借鑒SPT技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，將小麥花粉育性恢復(fù)基因Ms1、花粉致死基因ZmAA1、熒光篩選基因DsRed2及其特異性花藥啟動子和終止子序列構(gòu)建了小麥隱性恢復(fù)基因表達(dá)載體pGEII-Ms1-ZmAA1-DsRed2，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，并利用紅色熒光對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行驗(yàn)證，說明小麥隱性恢復(fù)基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。鑒于小麥轉(zhuǎn)化難度較大，尤其是冬小麥基因型的復(fù)雜性，所以本研究暫時未能獲得轉(zhuǎn)基因小麥材料。下一步的工作重點(diǎn)是建立現(xiàn)有隱性核不育小麥材料(冬小麥)的再生體系，然后將構(gòu)建好的小麥隱性恢復(fù)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到隱性核不育小麥材料中，從而獲得新型的隱性核不育系，為采用該技術(shù)體系開展雜交小麥的育種提供理論和材料 依據(jù)。