楊柳青，楊美虹，劉 波，張 倩，李新霞，

(1.鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院病理科，河南洛陽 471099；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830011)

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一種發(fā)病率較高的非霍奇金淋巴瘤，約占世界上B 細(xì)胞淋巴瘤的37%[1]。DLBCL 具有多樣的分子和遺傳背景，導(dǎo)致疾病的發(fā)展具有異質(zhì)性[2]，由于DLBCL 的高侵襲活性，一部分患者預(yù)后較差，因此仍需要更敏感的診斷標(biāo)志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性小RNA 分子，約含20～22 個(gè)核苷酸，在基因調(diào)控中起重要作用，它們與特定的信使RNA(mRNA)配對，導(dǎo)致mRNA降解進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的翻譯[3]。早期循環(huán)DNA 的檢測數(shù)據(jù)表明，因血液中的miRNA 易于獲取，“血液活檢”方法已成為診斷DLBCL 的可行方法之一[4]。研究表明，早期診斷和及時(shí)治療可以降低患者死亡率[5]。然而，miRNA在DLBCL的診斷中的實(shí)際可行性還沒有完全闡明。本項(xiàng)研究借助GEO 數(shù)據(jù)庫篩選了DLBCL 中一些功能性miRNA，在miRTarBase預(yù)測其潛在靶基因，并通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能分析。此外，我們還利用Cytoscape 軟件構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用(proteinprotein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)和miRNA-核心基因(hub基因)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目的是篩選異常表達(dá)miRNA(differentially expressed microRNA，DE-miRNA)及其靶基因，并探討其在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 miRNA微陣列

從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)綜合數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GSE117063 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)譜基于GPL25327 Exiqon Human miRCURY LNA Universal RT miRNA PCR Human Serum/Plasma focus panel(V3.0)平臺(tái)，此平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是由Steffen J團(tuán)隊(duì)提供，共有31例血漿樣本，包含17例DLBCL患者和14例健康者樣本。

1.2 DE-miRNA及靶基因篩選

利用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析GSE117063 數(shù)據(jù)集中腫瘤和健康樣本間的DEmiRNA。GEO2R 是利用R 包和limma 軟件包分析GEO樣本基因差異表達(dá)的在線網(wǎng)絡(luò)工具，以P<0.05 和|log2(fold change)|>1.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將DE-miRNA導(dǎo)入miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(http://miRTarBase.cuhk.edu.cn/)，預(yù)測其調(diào)控的潛在靶基因。

1.3 基因功能分析

DAVID(version 6.8，http://david-d.ncifcrf.gov/)用來對基因進(jìn)行更深入的生物學(xué)功能分析，包括基因功能注釋(GO)和京都基因百科全書和基因組(KEGG)通路富集分析。GO 分析包含以下3 個(gè)方面：細(xì)胞組分(cell component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)。將靶基因?qū)隓AVID 網(wǎng)站，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，取P值前5 位基因功能及前20條基因富集通路進(jìn)行分析。

1.4 PPI與miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析上述靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合得分>0.4的交互作用結(jié)果被認(rèn)為是顯著的，將STRING 數(shù)據(jù)庫得到的互作基因?qū)隒ytoscape 軟件，用CytoHubba 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)連通性進(jìn)行分析，構(gòu)建miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)，獲得核心基因(hub基因)，選取前10個(gè)hub基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.5 GEPIA基因驗(yàn)證

基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA，http://gepia.cancerpku.cn/index.html)是基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤和正常樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析的一個(gè)網(wǎng)站，其所選樣本亦有相關(guān)專業(yè)醫(yī)師的指導(dǎo)[6]。本研究用此網(wǎng)站驗(yàn)證hub基因在DLBCL 組織和正常淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，結(jié)果以箱視圖呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 DE-miRNA及其靶基因

通過對GSE117063數(shù)據(jù)集的分析，與健康對照組相比，DLBCL 患者血漿中共檢測出81 個(gè)DE-miRNA，其中17 個(gè)上調(diào)，64 個(gè)下調(diào)(P<0.05)，從上調(diào)和下調(diào)的miRNA 中篩選表達(dá)差異程度前3 位miRNA，見表1、表2。借助miRTarBase，預(yù)測出上調(diào)miRNA-326、miRNA-33a-5p、miRNA-199a-5p 的潛在靶基因471個(gè)，下調(diào)miRNA-205-5p、miRNA-375、miRNA-885-5p的靶基因705個(gè)。

表1 表達(dá)上調(diào)程度前10位的DE-miRNA

表2 表達(dá)下調(diào)程度前10位的DE-miRNA

2.2 GO分析

靶基因的GO分析如表3、表4所示，上調(diào)miRNA的靶基因主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性和序列特異性DNA結(jié)合。其介導(dǎo)的分子富集在RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)的正調(diào)控，DNA模板化等生物過程中。而下調(diào)miRNA 的靶基因參與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA 模板化、病毒過程、凋亡過程、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控等生物過程。此外，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、同一蛋白結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄輔激活子活性等分子功能。

表3 前3位上調(diào)DE-miRNA的靶基因的GO分析

表4 前3位下調(diào)DE-miRNA的靶基因的GO分析

2.3 KEGG通路富集分析

靶基因的KEGG 通路富集分析見圖1，上調(diào)miRNA 的靶基因富集在癌癥中的通路、HTLV-I 感染通路、癌癥中的miRNA 和蛋白多糖以及Hippo 信號(hào)通路等。而下調(diào)miRNA的靶點(diǎn)富集在癌癥中的通路、蛋白多糖、miRNA、PI3K-Akt信號(hào)途徑和病毒致癌作用等通路。

圖1 miRNA靶基因的KEGG分析

2.4 PPI和miRNA-hub基因網(wǎng)絡(luò)分析

在STRING 中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)蛋白質(zhì)(基因)之間相互作用的節(jié)點(diǎn)度挑選前10個(gè)hub基因，其結(jié)果如表5所示。上調(diào)miRNA 的hub基因是絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、v-myc 骨髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因同源物(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、鈣黏蛋白1(cadherin 1，CDH1)、NOTCH1、SRC 原癌基因-非受體酪氨酸激酶(SRC proto-oncogene，nonreceptor tyrosine kinase，SRC)、KRAS原癌基因-GTP酶(KRAS proto-oncogene，GTPase，KRAS)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、酪氨酸激酶受體2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2)。下調(diào)miRNA的hub基因有腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、MYC、磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、SRC、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、VEGFA、連環(huán)蛋白β1(catenin β1，CTNNB1)、細(xì)胞分裂周期42(cell division cycle 42，CDC42)、熱休克蛋白90α家族A 類成員1(heat shock protein 90α family class A member 1，HSP90AA1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。其中，6個(gè)hub基因被上調(diào)的miRNA-326 所調(diào)控，下調(diào)的miRNA-375 指向7 個(gè)hub基因，如圖2。

表5 PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因

圖2 miRNA-hub基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 GEPIA基因驗(yàn)證

在上述hub 基因中，AKT1、CCND1、ERBB2、TP53、MYC、CTNNB1和HSP90AA1基因在DLBCL 中的表達(dá)均較正常組織升高，可視化的箱線圖如圖3 所示，其中AKT1、CCND1、ERBB2為miRNA-326 的靶基 因，而TP53、MYC、CTNNB1、HSP90AA1為miRNA-375的靶基因。

圖3 DLBCL和正常樣本中hub基因表達(dá)水平

3 討論

DLBCL是一種高侵襲性的腫瘤，由于發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，早期診斷仍有許多困難。有研究表明，miRNA由腫瘤細(xì)胞釋放到循環(huán)血液中，以穩(wěn)定的無細(xì)胞形式存在，并且血漿中miRNA譜在腫瘤和正常樣本中是有差異的，因此可作為生物標(biāo)志物輔助疾病診斷和治療[7]。

GO 分 析顯示，DLBCL 中DE-miRNA 的作用靶 點(diǎn)主要集中在基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞增殖調(diào)控以及細(xì)胞凋亡過程中。值得注意的是，上調(diào)或下調(diào)miRNA的靶基因都富集在細(xì)胞分裂和增殖的正調(diào)控，其可能在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中起重要作用。

KEGG 分析顯示靶基因主要富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路，人T 細(xì)胞白血病病毒1 型(HTLV-1)感染以及細(xì)胞基質(zhì)的蛋白多糖等通路。目前，病毒感染作為DLBCL的病因已成為后基因組時(shí)代的研究熱點(diǎn)，本研究中，KEGG通路分析亦顯示靶基因富集在HTLV-I病毒感染相關(guān)的通路。HTLV-I 主要感染CD4+T 淋巴細(xì)胞，Tax 是NF-κB 信號(hào)通路的有效激活劑，對HTLV-1感染的T細(xì)胞的存活和增殖至關(guān)重要[8]。蛋白多糖是由核心蛋白和多糖鏈組成的復(fù)雜大分子，分布在細(xì)胞外基質(zhì)中，也存在于細(xì)胞表面和分泌顆粒中[9]。研究證明，蛋白多糖在免疫系統(tǒng)中起著重要作用，參與淋巴細(xì)胞增殖和遷移、炎癥反應(yīng)過程和B 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā) 展[10]。本研究中，靶基因ERBB3、ERBB2、CTNNB1、CDC42、MYC、TP53、STAT3參與了蛋白多糖在腫瘤中的表達(dá)，其中ERBB2、CTNNB1、MYC、TP53在DLBCL中的表達(dá)異常。

通過構(gòu)建miRNA-hub 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，大多數(shù)hub基因可能受到miRNA-326 和miRNA-375 的調(diào)控。AKT1屬于AKT 蛋白家族，AKT 蛋白激酶在細(xì)胞生長過程中起著關(guān)鍵作用，如參與糖代謝、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、遷移和凋亡[11]。本團(tuán)隊(duì)一直致力于DLBCL發(fā)生機(jī)制及通路的研究，借助NanoString-nCounter 技術(shù)檢測PI3K主要催化亞基和調(diào)控亞基的擴(kuò)增和缺失及其下游AKT 的亞基拷貝數(shù)，提示PI3K-Akt 通路可能在DLBCL 的發(fā)生和AKT 信號(hào)通路的激活中起重要作用[12]。與此對應(yīng)，王晶等[13]的miRNA 圖譜表明，與AKT 靶點(diǎn)相關(guān)的miRNA 在DLBCL 中也存在差異表達(dá)。HSP90AA1是HSP 家族的重要成員，是細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中合成的分子伴侶，通常在腫瘤組織中高表達(dá)。此外，熱休克蛋白有助于腫瘤細(xì)胞的生長、繁殖和浸潤[14]。CCND1是一種原癌基因，其過度表達(dá)可導(dǎo)致惡性細(xì)胞增殖，腫瘤形成[15]。ERBB2編碼的蛋白質(zhì)屬于表皮生長因子受體家族，通過磷酸化激活MAPK和PI3K等下游蛋白質(zhì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[16]。MYC基因作為一種原癌基因，在易位后具有高轉(zhuǎn)錄活性，在缺氧狀態(tài)下可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞代謝，從而削弱治療對腫瘤細(xì)胞的致死作用，影響患者預(yù)后[17]。編碼β-catenin 的癌基因CTNNB1在腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散中起重要作用，通過破壞β-catenin 復(fù)合物激活Wnt信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1的突變參與了癌癥的發(fā)病機(jī)制[18-19]。p53蛋白是一種核磷酸化蛋白，在快速清除受損和潛在腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。p53突變后轉(zhuǎn)化為癌基因，導(dǎo)致對細(xì)胞生長的失調(diào)。Voropaeva等的研究證實(shí)，TP53基因可能是淋巴瘤中有意義的預(yù)后生物標(biāo)志物[20]。目前，大多數(shù)hub 基因已被研究參與許多經(jīng)典的信號(hào)通路，如PI3K-Akt 和NF-κB 通路，但調(diào)控基因的miRNA(miRNA-326 和miRNA-375)在DLBCL中的作用有待進(jìn)一步研究。

既往研究中，miRNA-326作為一種腫瘤抑制因子參與了多種腫瘤的病理過程，包括肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等[21-23]。而miRNA-375 在乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺腺癌中過度表達(dá)，這可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[24-26]。相反，研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的miRNA-326在正常組織中幾乎檢測不到，但在急性髓系白血病(AML)中大量存在[27]，且下調(diào)miRNA-375有助于AML中的腫瘤細(xì)胞增殖和集落形成[28]，與之一致，本研究亦發(fā)現(xiàn)DLBCL患者中miRNA-326 表達(dá)上調(diào)，miRNA-375 表達(dá)下調(diào)。然而，目前的研究仍存在一些局限性，對于miRNA-326、miRNA-375 及hub 基因的表達(dá)水平缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，尚需進(jìn)一步分析。

綜上，DLBCL 相關(guān)的miRNA 和hub 基因可能在DLBCL的發(fā)生發(fā)展中起重要作用?；谏镄畔W(xué)分析，本研究成功地篩選出DLBCL血清中兩個(gè)異常表達(dá)的miRNA(上調(diào)的miRNA-326和下調(diào)的miRNA-375)及其潛在的靶基因(AKT1、CCND1、ERBB2、TP53、MYC、CTNNB1和HSP90AA1)，為DLBCL 的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。