涂永梅，于衛(wèi)華，彭 潔，劉江正，劉 瑞，吳 昊，孔德欽，何改花，李文麗，王 沖

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032)

炎癥是臨床上最常見(jiàn)病理過(guò)程，其本質(zhì)是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放。巨噬細(xì)胞(macrophages，m?)是機(jī)體最主要的炎癥細(xì)胞，在多數(shù)器官和組織中大量分布，按功能可分為促炎(M1)型和抗炎(M2)型兩大類[1-2]。以往研究顯示，在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或γ干擾素(interferon，IFN-γ)等因子刺激下，巨噬細(xì)胞發(fā)生M1 型極化，生成大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、一氧化氮(NO)等促炎因子，是機(jī)體殺滅細(xì)菌和抗病毒的重要武器。相反，在IL-4等刺激下巨噬細(xì)胞發(fā)生M2 型極化，可分泌大量抗炎因子如白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、精氨酸酶(arginase 1，Arg-1)和甘露糖受體206(亦稱CD206)等，參與機(jī)體炎癥消除和創(chuàng)傷修復(fù)[3]。研究表明，巨噬細(xì)胞及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在肥胖、腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。其中，M2型巨噬細(xì)胞可通過(guò)生成抗炎因子調(diào)控機(jī)體炎癥消退，被認(rèn)為是炎癥疾病治療的新靶點(diǎn)。

鳶尾素(irisin，IR)是由112 個(gè)氨基酸組成的多肽，2012 年美國(guó)哈佛大學(xué)布魯斯團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)[6]并證實(shí)了運(yùn)動(dòng)后鳶尾素水平顯著上升。研究表明人體鍛煉后肌肉可分泌過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1(proliferator-activated-receptor-γ co-activator 1α，PGC1α)，進(jìn)而刺激纖維連結(jié)蛋白III 型域包含蛋白5(FNDC5) mRNA 表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)NDC5 蛋白在經(jīng)過(guò)水解、糖基化和二聚化后，釋放包含III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的新蛋白質(zhì)，即為鳶尾素。而鳶尾素可激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ)，促進(jìn)白色脂肪的棕色化，增強(qiáng)機(jī)體熱量消耗，進(jìn)而改善肥胖和糖尿病。最新研究[7]發(fā)現(xiàn)20 min的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，人體血液中TNF-α等炎癥因子水平降低，提示運(yùn)動(dòng)具有抗炎作用。而鳶尾素作為一種運(yùn)動(dòng)因子，可能在炎癥反應(yīng)和氧化損傷過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。鳶尾素干預(yù)可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體和核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，阻斷M1 型巨噬細(xì)胞促炎信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]，但鳶尾素是否影響巨噬細(xì)胞M2型極化尚不清楚。因此，本文旨在研究鳶尾素對(duì)巨噬細(xì)胞抗炎和抗氧化作用，即巨噬細(xì)胞M2 型極化的影響及其調(diào)控機(jī)制，為鳶尾素相關(guān)臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)由空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞庫(kù)提供；鳶尾素購(gòu)自山東金威斯生物(00170-01-100)，純度98%；LPS 購(gòu)自Sigma 公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorodiacetate，DCFH-DA)熒光探針購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Mito-LX 熒光探針由西北大學(xué)柔性電子研究所贈(zèng)送；小鼠IL-10、Arg-1和CD206酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自上?？婆d生物；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)酶活性試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾公司；PPAR-γ抑制劑T0070907 購(gòu)自中國(guó)MCE 公司(HY-13202)；PPAR-γ 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京TIANGEN 公司；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS等常用試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器超凈臺(tái)(ESCO，新加坡)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(FLUOstar Omega，德國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))；PCR 儀、電泳和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 方 法

1.2.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)及炎癥模型建立RAW264.7 細(xì)胞加入DMEM 高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)。100 ng/mL LPS處理細(xì)胞24 h后，建立炎癥模型[9]。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定相關(guān)因子mRNA 的表達(dá)接種RAW264.7 細(xì)胞于6 孔板，根據(jù)文獻(xiàn)[10]提示，選用50、100、200 ng/mL 鳶尾素處理細(xì)胞24 h 后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)IL-10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，以選擇合適鳶尾素劑量。各組細(xì)胞處理完畢后，使用TIANGEN試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。小鼠IL-10、Arg-1、CD206、PPAR-γ、β-actin、TNF-α、IL-6、HO-1、SOD2 和Nrf2 的引物由北京擎科生物合成，序列如表1 所示。以cDNA 為模板使用SYBR Green PCR master Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)擴(kuò)增，使用兩步法，擴(kuò)增程序設(shè)定如下：95 ℃、30 s；95 ℃，5 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，按2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息

1.2.3 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清IL-10、Arg-1 和CD206濃度實(shí)驗(yàn)設(shè)200 ng/mL 鳶尾素處理細(xì)胞0、24 和48 h共3組。樣品處理完成后收集細(xì)胞上清，標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū)稀釋液為0、25、50、100、200、400 pg/mL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃條件下孵育2 h，清洗后加入檢測(cè)工作液，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(450)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-10、Arg-1和CD206濃度。

1.2.4 巨噬細(xì)胞形態(tài)和促炎因子表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、100 ng/mL LPS 組和200 ng/mL 鳶尾素+100 ng/mL LPS 聯(lián)合組處理巨噬細(xì)胞24 h后，倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)。用200 mg/mL 鳶尾素預(yù)處理4 h，再用100 ng/mL LPS 刺激巨噬細(xì)胞24 h 后，采用qPCR 檢測(cè)TNF-α 和IL-6 mRNA 的 表達(dá)，方法 同1.2.2。

1.2.5 線粒體ROS 水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、100 ng/mL LPS 組、200 ng/mL鳶尾素組和200 ng/mL鳶尾素+100 ng/mL LPS 聯(lián)合組共4 組，每組處理細(xì)胞24 h。再用兩種熒光染色進(jìn)行線粒體ROS 水平的檢測(cè)。DCFH-DA 是一種通用活細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)指示探針，本身無(wú)熒光，但被細(xì)胞酯酶水解后形成DCF 可發(fā)出綠色熒光。Mito-LX 是新型線粒體靶向熒光探針，可選擇性進(jìn)入線粒體識(shí)別H2O2，發(fā)出紅色熒光。細(xì)胞處理后分別加入終濃度為5 μmol/L 的DCFH-DA 和Mito-LX 熒光探針，37 ℃條件下孵育30 min，PBS 清洗后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。其中，DCF 選擇FL1-A 通道，而Mito-LX 選擇FL2-A通道。

1.2.6 抗氧化酶活性檢測(cè)細(xì)胞分成200 ng/mL 鳶尾素處理細(xì)胞0、24 和48 h 組共3 組，處理完畢后離心收集細(xì)胞，用qPCR 檢測(cè)SOD2 和HO-1 mRNA 的表達(dá)。另外分別按照SOD、CAT和GSH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)抗氧化酶活性。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)Nrf2 和PPAR-γ亞細(xì)胞定位細(xì)胞分為對(duì)照組和200 ng/mL 鳶尾素組共2 組，處理細(xì)胞24 h，分別檢測(cè)Nrf2 和PPAR-γ的細(xì)胞定位。細(xì)胞分別接種于共聚焦培養(yǎng)皿，處理完畢后，用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100 透膜10 min。5%的蛋白封閉液室溫孵育30 min。加入1∶100稀釋的兔來(lái)源Nrf2和PPAR-γ一抗，37 ℃濕盒中孵育過(guò)夜。PBS 洗細(xì)胞3 次，加入1∶100 稀釋的Cy3 標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h。最后加入終濃度為10 μg/mL 的DAPI，37 ℃染色30 min。PBS 洗滌細(xì)胞3 次，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度，Cy3(紅色)Ex/Em：550 nm/570 nm；DAPI(藍(lán)色)Ex/Em：340 nm/488 nm。

1.2.8 qPCR 和Western blot 測(cè)定細(xì)胞中PPAR-γ表達(dá)細(xì)胞分成200 ng/mL 鳶尾素處理細(xì)胞0、24 和48 h組共3組，處理完畢后收集細(xì)胞，一部分細(xì)胞用qPCR檢測(cè)PPAR-γ mRNA的表達(dá)；一部分細(xì)胞按100∶1∶1比例加入細(xì)胞組織快速裂解液、絲氨酸蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，12 000 r/min 離心10 min，提取蛋白后BCA法定量，分裝保存于-80 ℃。然后配制SDS-PAGE 凝膠，按每孔40 μg 加入蛋白樣品，垂直電泳儀，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉2 h。按照1∶1 000 濃度加入PPAR-γ一抗，4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST 洗滌后顯影成像，計(jì)算蛋白相對(duì)含量。

1.2.9 使用PPAR-γ特異性抑制劑T0070907 驗(yàn)證鳶尾素介導(dǎo)PPAR-γ信號(hào)激活為闡明PPAR-γ在鳶尾素抗炎中的關(guān)鍵作用，使用PPAR-γ特異性抑制劑T0070907 干預(yù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組，5、10 及30 μmol/L T0070907 組共4 組，將細(xì)胞接種于6 孔板，處理24 h后，檢測(cè)不同濃度T0070907對(duì)抗炎因子相對(duì)表達(dá)水平變化的影響。在明確了T0070907最佳劑量后，細(xì)胞分對(duì)照組，T0070907 組及T0070907+鳶尾素組共3 組，處理24 h 后，采用qPCR 檢測(cè)抗炎因子mRNA 表達(dá)變化，方法同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prim 8.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，One-way ANOVA 用于方差齊性檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)用于組間兩兩比較，數(shù)據(jù)用表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 鳶尾素促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞M2型極化及抗炎因子釋放

結(jié)果見(jiàn)圖1A。200 ng/mL 的鳶尾素抗炎效果最明顯，因此選擇這一劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qPCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，200 ng/mL鳶尾素刺激24和48 h后巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物CD206 表達(dá)明顯升高(P<0.05)，抗炎因子IL-10和Arg-1 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。ELISA 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 ng/mL 鳶尾素處理后培養(yǎng)上清中CD206、IL-10和Arg-1濃度較對(duì)照組顯著增多(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖1C～E。上述研究提示，鳶尾素刺激后巨噬細(xì)胞發(fā)生M2 型極化，并釋放大量抗炎因子。

圖1 鳶尾素刺激RAW264.7后CD206和抗炎因子表達(dá)變化

2.2 鳶尾素抑制LPS 介導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞促炎因子的水平

鳶尾素和脂多糖處理后RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖2A。RAW264.7 細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞系，正常培養(yǎng)條件下貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為圓形或橢圓形，體積較小。在LPS 刺激下，細(xì)胞會(huì)被激活并伴有形態(tài)和功能的改變，主要表現(xiàn)為形態(tài)不規(guī)則，胞體增大，大量偽足出現(xiàn)。而加入鳶尾素處理后，細(xì)胞數(shù)目增多，形態(tài)改變不明顯。qPCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6 水平，結(jié)果見(jiàn)圖2B～C。與對(duì)照組比較，LPS刺激后TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，鳶尾素干預(yù)可有效抑制LPS 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎因子的釋放(P<0.05)。上述結(jié)果表明，鳶尾素可以有效抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖2 鳶尾素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞形態(tài)變化及促炎因子TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

2.3 鳶尾素抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞ROS 生成增多

采用DCFH-DA 和Mito-LX 染色檢測(cè)細(xì)胞和線粒體內(nèi)ROS 水平，結(jié)果見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較，100 ng/mL LPS 處理后細(xì)胞DCF 和Mito-LX 熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)；與LPS組相比，給予200 ng/mL 鳶尾素可抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體水平(P<0.05)。上述結(jié)果表明鳶尾素具有抗氧化作用，可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS 生成增多。

圖3 鳶尾素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞ROS生成的影響

2.4 鳶尾素增強(qiáng)RAW264.7 細(xì)胞Nrf2 及下游抗氧化酶表達(dá)

Nrf2及下游抗氧化酶系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗ROS 的重要因子。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4A，200 ng/mL 鳶尾素處理RAW264.7 細(xì)胞48 h，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 熒光亮度增強(qiáng)，且發(fā)生明顯核轉(zhuǎn)位。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nrf2下游抗氧化酶SOD2 和HO-1 mRNA 升高(P<0.05)(圖4B)。進(jìn)一步檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，鳶尾素組SOD和CAT酶活性、以及GSH 含量均顯著增加(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4C～E。上述結(jié)果證明，鳶尾素促進(jìn)Nrf2 及下游抗氧化酶表達(dá)。

圖4 鳶尾素對(duì)RAW264.7細(xì)胞Nrf2及下游抗氧化酶表達(dá)的影響

2.5 鳶尾素增強(qiáng)抗炎啟動(dòng)因子PPAR-γ的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位

PPAR-γ是調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞抗炎因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控分子[11]，在正常情況下表達(dá)較低且存在于胞質(zhì)，與配體結(jié)合后可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核啟動(dòng)下游抗炎信號(hào)[12]。免疫熒光結(jié)果表明，200 ng/mL鳶尾素處理細(xì)胞后PPAR-γ熒光增強(qiáng)，且出現(xiàn)大量核內(nèi)聚集現(xiàn)象(圖5A)。qPCR 和Western blot 進(jìn)一步證實(shí)，鳶尾素促進(jìn)了PPAR-γ表達(dá)升高(P<0.05)(圖5B～D)。上述結(jié)果證實(shí)，鳶尾素可增強(qiáng)PPAR-γ信號(hào)的轉(zhuǎn)錄激活。

圖5 鳶尾素對(duì)RAW264.7細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)和定位的影響

2.6 鳶尾素的抗炎效應(yīng)依賴于調(diào)控PPAR-γ信號(hào)激活

分別使用5、10、30 μmol/L PPAR-γ特異性抑制劑T0070907 干預(yù)細(xì)胞24 h 后，采用qPCR 檢測(cè)IL-10、Arg-1 和PPAR-γ mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，30 μmol/mL T0070907 效果最顯著(P<0.05，圖6A)，因此，我們選用此劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)200 ng/mL 鳶尾素促進(jìn)了CD206 和Arg-1 mRNA 表達(dá)，而用30 μmol/mL T0070907 處理24 h 后，阻斷了鳶尾素介導(dǎo)抗炎因子CD206 和Arg-1 mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)(圖6B)。此結(jié)果表明，鳶尾素介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)依賴于PPAR-γ信號(hào)激活。

圖6 T0070907對(duì)鳶尾素介導(dǎo)抗炎效應(yīng)的影響

3 討論

炎癥反應(yīng)是機(jī)體重要的防御反應(yīng)，也是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程，90%以上臨床疾病均存在炎細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥病理過(guò)程[12]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體最主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，廣泛存在于各組織器官，其募集和激活在維持機(jī)體健康中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，巨噬細(xì)胞M2 型激活后可釋放IL-10 和Arg-1 等抗炎因子，參與調(diào)控炎癥消退和創(chuàng)傷愈合[13]。因此，尋找安全有效的M2型巨噬細(xì)胞刺激因子是疾病治療的新思路。

鳶尾素是運(yùn)動(dòng)后由肌肉組織大量分泌的因子，對(duì)于維持機(jī)體健康具有諸多有益作用。研究發(fā)現(xiàn)，將鳶尾素注射給高脂飲食小鼠，可促進(jìn)白色脂肪組織棕色化，增強(qiáng)脂肪消耗，顯著改善動(dòng)物肥胖癥狀[14]。而糖尿病患者血液中鳶尾素水平降低，給予鳶尾素可顯著降低血糖，增強(qiáng)胰島素敏感性[15-16]。此外，鳶尾素還能改善病理性心臟肥大，抑制缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡[17]。最新研究提示，適度運(yùn)動(dòng)有助于降低機(jī)體促炎因子，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)[18]。鳶尾素可降低肥胖和糖尿病體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，改善LPS 誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的肝臟、肺臟、心臟和腎臟炎癥，提示鳶尾素可能是運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的抗炎因子。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鳶尾素處理RAW264.7 細(xì)胞CD206 表達(dá)顯著升高，并釋放IL-10 和Arg-1 抗炎因子；此外，鳶尾素可抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)升高，提示鳶尾素具有抗炎保護(hù)作用。

研究表明[19-20]，氧化還原與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，ROS 劑量不同對(duì)炎癥信號(hào)的影響也存在差異，當(dāng)ROS增多或抗氧化減弱有利于巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)，而ROS減少或抗氧化增強(qiáng)有助于巨噬細(xì)胞抗炎分化。在病理?yè)p傷條件下，ROS 可通過(guò)NF-κB、NLRP3 和COX2 等多種炎癥信號(hào)通路，調(diào)控M1 型巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)。給予抗氧化劑能清除ROS 并阻斷LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)。同時(shí)，抗氧化劑還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化，通過(guò)分泌抗炎因子改善肥胖、心肌梗死、糖尿病和急性肺損傷。研究表明，鳶尾素處理可抑制ROS水平，減輕低密度脂蛋白造成的血管損傷和血管緊張素II 引起的心臟纖維化。鳶尾素可通過(guò)激活A(yù)kt 信號(hào)通路來(lái)減輕氧化應(yīng)激，改善糖尿病小鼠的心肌損傷[21]。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其磷酸化和和轉(zhuǎn)位對(duì)于下游抗氧化酶譜的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)具有至關(guān)重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)200 ng/mL 鳶尾素刺激可顯著增強(qiáng)Nrf2 及下游抗氧化酶SOD2 和HO-1 表達(dá)，降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS 生成。因此，我們認(rèn)為鳶尾素通過(guò)激活Nrf2啟動(dòng)抗氧化信號(hào)，進(jìn)而參與調(diào)控巨噬細(xì)胞抗炎反應(yīng)。

PPAR-γ屬于核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族的關(guān)鍵蛋白，主要通過(guò)配體結(jié)合途徑激活，參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝，在肥胖和糖尿病等疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。1988 年，Ricote 課題組首次在Nature 雜志報(bào)道[18]，PPAR-γ信號(hào)激活可抑制巨噬細(xì)胞炎癥，改善小鼠膿毒癥。2014 年法國(guó)巴斯德研究所研究報(bào)道[21]，PPAR-γ激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化，并上調(diào)CD206、IL-10 和Arg-1 等抗炎因子表達(dá)。研究表明，羅格列酮等PPAR-γ激動(dòng)劑可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗炎反應(yīng)，改善多種急慢性炎癥疾病[22-23]。上述結(jié)果提示，PPAR-γ是巨噬細(xì)胞抗炎反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。以往報(bào)道[24]認(rèn)為，鳶尾素處理后可激活PPAR-γ，進(jìn)而調(diào)控脂肪酸和葡萄糖代謝的穩(wěn)態(tài)，改善肥胖和糖尿病。我們的研究則證實(shí)，鳶尾素刺激巨噬細(xì)胞中PPAR-γ的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，且出現(xiàn)明顯核轉(zhuǎn)位，而PPAR-γ活性抑制劑T0070907 可逆轉(zhuǎn)鳶尾素介導(dǎo)的抗炎作用。因此，我們認(rèn)為PPAR-γ信號(hào)激活可能在鳶尾素介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激之間存在交互調(diào)控作用，炎癥過(guò)程中會(huì)釋放大量ROS，而ROS也會(huì)促進(jìn)多種炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，二者易形成惡性循環(huán)。同時(shí)，炎癥信號(hào)和氧化還原具有獨(dú)立的調(diào)控機(jī)制，炎癥反應(yīng)主要受到NF-κB和NLRP3等通路影響；而抗氧化信號(hào)主要受到以Nrf2為核心的抗氧化酶鏈和ROS 生成酶鏈的調(diào)控[25]。因此，單純使用抗炎和抗氧化藥物對(duì)于治療炎癥性疾病效果有限，無(wú)法根除問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素可通過(guò)激活PPAR-γ調(diào)控抗炎因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并可增強(qiáng)Nrf2及下游抗氧化酶表達(dá)，兼具抗炎和抗氧化的雙重功效，有望成為炎癥疾病治療的候選藥物。然而，本文也存在一定局限性，我們僅在RAW264.7 細(xì)胞系上驗(yàn)證了鳶尾素介導(dǎo)抗炎和抗氧化作用及其分子機(jī)制，應(yīng)在多種細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)一步明確其功能。此外，臨床上急慢性炎癥疾病治療，應(yīng)首先考慮控制感染、創(chuàng)傷和中毒等炎癥因子產(chǎn)生的源頭。