蔡 嬌，孔德欽，龍 子，彭 潔，劉江正，劉 瑞，海春旭

(空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

藥物性肝損傷是一個(gè)嚴(yán)重的臨床問題[1]。對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，又名撲熱息痛，是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，作為一種非處方藥極易獲得，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。APAP 在治療劑量下通常是安全的，但過量使用則易造成急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)[2-3]。ALF 危及生命，肝移植成了唯一的救治途徑[4]。目前，APAP所致急性肝細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不完全清楚，有研究認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是其重要的生物學(xué)機(jī)制[5]，而線粒體又在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此，探究其確切機(jī)制非常必要。

研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)/IL-1R 信號(hào)通路在非酒精性脂肪性肝炎中起關(guān)鍵作用[6]。白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)作為TLR/IL-1R介導(dǎo)級(jí)聯(lián)信號(hào)激活的主要激酶，是IRAK 家族重要的信號(hào)分子[7]。IRAK4 對(duì)于機(jī)體正常發(fā)揮先天性免疫和適應(yīng)性免疫是必不可少的[8]。另外，IRAK4 在心臟炎癥[9]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]中也發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是炎癥性疾病一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)[11]。然而，在APAP 誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷中IRAK4 的作用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)以人肝細(xì)胞系L02 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，初步探究了IRAK4 分子在APAP 誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人正常肝細(xì)胞系L02 由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所提供，用含10% FBS 和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02 細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，再以含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基等體積中和，將細(xì)胞吹打均勻，稀釋成單細(xì)胞懸液備用。

1.2 主要試劑與儀器

APAP和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、雙抗(青霉素及鏈霉素)、PBS 以及0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco 公司；CCK-8 購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司；Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；JC-1染料購(gòu)自南京建成生物工程研究所；MitoSOX 和轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Glpbio 公司；Tubulin、IRAK4和羊抗兔IgG(H&L)-HRP(二抗)均購(gòu)自Biorbyt公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；小干擾RNA產(chǎn)品購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。

主要儀器有：醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(SW-CJ，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo for 3111/371，美國(guó))；正置熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51，Olympus 公司，日本)；全波段酶標(biāo)儀(infinite M200 PRO，奧地利)；流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6，美國(guó))；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(3K30，Sigma公司，德國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Bio-Rad CFX96，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.3 方 法

1.3.1 CCK-8 法檢測(cè)L02 細(xì)胞的活力將單細(xì)胞懸液以4×105個(gè)/mL 的濃度接種于96 孔板，每孔100 μL，接種時(shí)注意將細(xì)胞混勻，培養(yǎng)板四周用PBS 填充，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞全部貼壁后，分別用2.5、5、10、20、40、80 mmol/L(200 μL/孔)APAP 作用24 h，另用20 mmol/L APAP(200 μL/孔)分別處理0、6、12 和24 h 后，吸棄APAP 并加入CCK-8 工作液，每孔100 μL，37 ℃作用2 h 后，用全波段酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，按照CCK-8 試劑盒說明書計(jì)算各組L02細(xì)胞的存活率。

1.3.2 Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將L02細(xì)胞以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔2 mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿約80%孔底面積時(shí)，加入2 mL 終濃度為20 mmol/L 的APAP，然后分別在0、6、12 和24 h 收集細(xì)胞，用PBS 洗兩次后則按照Annexin V/PI 試劑盒說明書的步驟，每個(gè)樣品分別加入500 μL 結(jié)合緩沖液、Annexin V 和PI 各5 μL，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣。數(shù)據(jù)獲取和分析均采用CFlowPlus軟件。

1.3.3 線粒體活性氧和膜電位的檢測(cè)MitoSOX 是活細(xì)胞中的一種特異性靶向線粒體的新型熒光染料[12]。MitoSOX 紅色試劑滲透入活細(xì)胞中，并選擇性靶向線粒體，而后被超氧化物快速氧化，氧化產(chǎn)物則結(jié)合核酸并產(chǎn)生大量紅色熒光。紅色熒光的強(qiáng)弱可反映線粒體活性氧的水平。紅色熒光越強(qiáng)，表明線粒體活性氧水平越高，反之，則表明線粒體活性氧水平降低。而JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針[13]。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例。本實(shí)驗(yàn)將L02細(xì)胞懸液以3×104/mL 的濃度接種于4 個(gè)激光共聚焦小皿，每皿2 mL，培養(yǎng)過夜后，加入2 mL 終濃度為20 mmol/L 的APAP，然后分別在0、6、12 和24 h 后處理細(xì)胞，分別按照MitoSOX試劑盒和JC-1試劑盒操作說明進(jìn)行染色，37 ℃避光孵育30 min，棄染色液，用PBS 洗2 次，使用熒光顯微鏡拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的分析。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)IRAK4 mRNA 表達(dá)將L02細(xì)胞以3×106個(gè)/mL接種到6 cm培養(yǎng)皿中，每皿3 mL，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁且細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，給予終濃度為20 mmol/L 的APAP 處理，分別設(shè)對(duì)照組(0 h)、6、12和24 h組，到對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后消化細(xì)胞，按照總RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒以及熒光定量試劑盒說明書操作。以Actin 為內(nèi)參，用qPCR 儀檢測(cè)細(xì)胞中IRAK4 mRNA 的表達(dá)量。引物序列為：Actin，5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′；IRAK4，5′-CCTGAC TCCTCAAGTCCAGAA-3′，5′-ACAGAAATGGGTCGT TCATCAAA-3′。

1.3.5 Western blot檢測(cè)IRAK4蛋白表達(dá)細(xì)胞分組處理同1.3.4。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后消化細(xì)胞，用RIPA 裂解液及BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取和定量，以β-tubulin為內(nèi)參，使用凝膠成像儀檢測(cè)細(xì)胞中IRAK4 蛋白的表達(dá)量，并用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.6 IRAK4 小干擾RNA(siRNA)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)化學(xué)合成siRNA 產(chǎn)品為凍干粉，在-20 ℃保存。使用前瞬時(shí)離心，用滅菌ddH2O 將靶基因siRNA 配制成20 μmol/L 儲(chǔ)存液，嚴(yán)格遵循RNA 操作規(guī)則，于冰上放置。對(duì)L02 細(xì)胞進(jìn)行siIRAK4 沉默轉(zhuǎn)染處理，預(yù)實(shí)驗(yàn)從siRNA 1/2/3 中篩選出最佳的siRNA，qPCR 檢測(cè)IRAK4 mRNA，結(jié)果顯示siRNA1 效果最為顯著，因此，選擇siRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(簡(jiǎn)稱siRNA)。

將IRAK4基因沉默后，將實(shí)驗(yàn)分為4 組，即正常對(duì)照組、APAP 處理組、siRNA 組(IRAK4 沉默組)和siRNA+APAP 組(IRAK4 沉默后使用APAP 干預(yù))。按前述方法分別檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和MitoSOX 染色檢測(cè)。

1.3.7 NAC 干預(yù)后檢測(cè)細(xì)胞活力和IRAK4 mRNA 表達(dá)預(yù)實(shí)驗(yàn)首先分別用1、2.5、5、10、20 mmol/L(200 μL/孔)NAC處理細(xì)胞，然后按前述CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10 mmol/L NAC干預(yù)細(xì)胞，并將細(xì)胞分為對(duì)照組、NAC 處理組、APAP處理組、NAC 和APAP 共處理組，最后用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，qPCR法檢測(cè)IRAK4 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞不同時(shí)間肝細(xì)胞損傷模型的建立

不同濃度APAP 作用24 h 可以誘導(dǎo)L02 細(xì)胞活力下降，且細(xì)胞損傷程度隨著劑量升高而增加，見圖1。與對(duì)照組相比，APAP 濃度在2.5、5、10、20、40、80 mmol/L 處理細(xì)胞24 h 后，L02 細(xì)胞活力逐漸下降，與對(duì)照組比較，其中20、40 和80 mmol/L APAP 處理組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由圖1A可知，APAP 濃度在20 mmol/L 時(shí)細(xì)胞損傷程度<50%，因此選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 APAP干預(yù)對(duì)L02細(xì)胞活力及形態(tài)的影響

采用20 mmol/L APAP 處理L02 細(xì)胞不同時(shí)間后，觀察各組細(xì)胞的形態(tài)情況如圖1B所示，對(duì)照組細(xì)胞完全貼壁，結(jié)構(gòu)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)清晰可見，APAP 處理12 和24 h 組部分細(xì)胞貼壁不好，細(xì)胞胞體有皺縮變圓現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量較正常組減少。各組細(xì)胞存活率如圖1C所示，L02細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較，在6 h和12 h無明顯變化，在24 h時(shí)顯著降低(P<0.05)。

2.2 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果見圖2。對(duì)照組正常細(xì)胞占92.4%，凋亡細(xì)胞為6.2%。與對(duì)照組相比，APAP 處理6 h 和12 h 后，細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而APAP處理24 h后，細(xì)胞凋亡率明顯增加且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明APAP處理細(xì)胞24 h可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.3 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)線粒體活性氧和膜電位的影響

MitoSOX 染色結(jié)果如圖3 所示。與對(duì)照組相比，20 mmol/L的APAP處理6、12和24 h后，紅色熒光逐漸增強(qiáng)，線粒體活性氧在24 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大。

圖3 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)線粒體活性氧的影響(n=3)

JC-1檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果及熒光強(qiáng)度分析如圖4所示。與對(duì)照組相比，20 mmol/L APAP干預(yù)6、12及24 h后，紅綠熒光的比值逐漸降低，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說明20 mmol/L APAP 處理后6～24 h均可降低線粒體膜電位。

圖4 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)線粒體膜電位的影響(n=3)

2.4 APAP干預(yù)不同時(shí)間對(duì)IRAK4表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)IRAK4 mRNA表達(dá)如圖5A所示。與對(duì)照組相比，用20 mmol/L APAP 處理24 h 后，IRAK4 mRNA 表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。Western blot 結(jié)果如圖5B所示。蛋白質(zhì)電泳圖和條帶灰度值分析(圖5C)結(jié)果均顯示，20 mmol/L APAP 處理24 h 后，IRAK4 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，與qPCR檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。

圖5 APAP干預(yù)不同時(shí)間后IRAK4 mRNA和蛋白的變化(n=3)

2.5 沉默IRAK4基因后再用APAP處理的作用

不同siRNA之間轉(zhuǎn)染效果的對(duì)比見圖6A。細(xì)胞活力檢測(cè)見圖6B，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)APAP 組細(xì)胞活力降低，siRNA 組細(xì)胞活力增加(P<0.05)。與APAP 組相比，siRNA+APAP 組細(xì)胞活力也明顯增加(P<0.05)。細(xì)胞凋亡的結(jié)果如圖6C 所示，與對(duì)照組相比，APAP組細(xì)胞凋亡程度增加；與APAP組相比，siRNA+APAP組細(xì)胞凋亡程度減小(圖6D)。MitoSOX 染色檢測(cè)結(jié)果如圖6E 所示，與對(duì)照組相比，APAP 組紅色熒光增強(qiáng)；與APAP 組相比，siRNA+APAP 組紅色熒光減弱(圖6F)。以上細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和線粒體活性氧的檢測(cè)結(jié)果均表明，與對(duì)照組和APAP 組相比，IRAK4基因沉默后，細(xì)胞損傷均出現(xiàn)不同程度的改善。

圖6 沉默IRAK4基因后再用APAP處理的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.6 NAC干預(yù)后細(xì)胞活力和IRAK4分子的變化

與對(duì)照組相比，NAC 濃度在20 mmol/L 時(shí)可以顯著誘導(dǎo)L02 細(xì)胞活力下降(P<0.05，如圖7A)，使細(xì)胞受到損傷，因此我們選用對(duì)細(xì)胞活力并無明顯影響的10 mmol/L NAC 進(jìn)行后續(xù)研究。采用20 mmol/L APAP 和10 mmol/L NAC 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，與對(duì)照組相比，APAP 干預(yù)后細(xì)胞活力下降(P<0.05)，而APAP和NAC 共處理后細(xì)胞活力升高(P<0.05)，說明NAC 對(duì)APAP 引起的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用(圖7B)。qPCR 檢測(cè)IRAK4 mRNA 表達(dá)結(jié)果(圖7C)顯示，與對(duì)照組相比，使用20 mmol/L APAP 處理24 h 后，IRAK4 mRNA表達(dá)水平升高，而APAP 和NAC 共處理后IRAK4 mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.05)，與CCK-8 檢測(cè)結(jié)果相符，同樣表明NAC 對(duì)APAP 引起的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

圖7 NAC干預(yù)后細(xì)胞活力和IRAK4 mRNA表達(dá)的變化

3 討論

目前，雖然關(guān)于APAP 毒性救治的藥物不斷創(chuàng)新，但用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)藥物仍僅有抗氧化劑NAC，但NAC存在許多局限性，比如只能用于疾病發(fā)生的早期[14]。APAP 致肝損傷機(jī)制也不十分清楚，研究發(fā)現(xiàn)，線粒體應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在APAP 引起的肝毒性中起著重要作用[15]。當(dāng)線粒體受損傷時(shí)，會(huì)持續(xù)產(chǎn)生高濃度的ROS，導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)和線粒體DNA 氧化受損，從而引起炎癥反應(yīng)[16]。

本文采用20 mmol/L的APAP處理L02細(xì)胞不同時(shí)間，建立了L02 細(xì)胞誘導(dǎo)APAP 肝損傷的體外模型。通過初步研究發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L APAP 干預(yù)24 h 后，L02 細(xì)胞的活力明顯降低，細(xì)胞形態(tài)也明顯改變。凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，20 mmol/L APAP 處理24 h 可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這與Liang 等[17]報(bào)道的10 mmol/L APAP 處理48 h 后引起細(xì)胞凋亡的結(jié)果不同，可能是由于所用APAP劑量和處理時(shí)間不同的原因。

IRAK4是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸-蘇氨酸激酶IRAK家族的成員之一。IRAK4在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病等炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[18]。當(dāng)前，IRAK4 分子主要是在Toll 樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，Wang 等[19]報(bào)道抑制IRAK4活性可有效減輕小鼠酒精性肝損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用20 mmol/L APAP 處理L02 細(xì)胞后，線粒體膜電位自6 h開始逐漸增加，線粒體ROS從12 h開始增高，24 h 可使細(xì)胞發(fā)生凋亡；且APAP 處理后IRAK4 蛋白表達(dá)量呈升高趨勢(shì)；通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)沉默IRAK4基因后發(fā)現(xiàn)，與APAP組相比，L02細(xì)胞活力有所增加、細(xì)胞凋亡程度減輕以及線粒體ROS減弱，表明肝細(xì)胞特異性IRAK4 分子可能參與了APAP 引起的急性肝損傷。由于線粒體ROS在12 h升高，而IRAK4分子在24 h升高，據(jù)此我們推測(cè)可能是由于ROS起到了明顯的調(diào)控作用。當(dāng)我們?cè)贏PAP 處理L02 細(xì)胞的基礎(chǔ)上使用ROS清除劑NAC進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞活力明顯升高，IRAK4分子表達(dá)下降，這體現(xiàn)了NAC的抗氧化作用，也說明ROS可能調(diào)控IRAK4。

APAP 肝損傷機(jī)制非常復(fù)雜，包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、代謝和自噬等，炎癥作為其中一個(gè)重要機(jī)制被廣泛研究，已知線粒體是APAP 肝毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，過量的APAP 引起ROS 升高和線粒體氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式的釋放(包括線粒體DNA、核DNA片段和TLRs等)，進(jìn)而激活促炎細(xì)胞因子的形成[2]。鑒于IRAK4 分子在炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路中占據(jù)著中心位置，我們推測(cè)IRAK4分子在APAP 誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前，APAP 肝毒性機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明，治療藥物也需深入探索，我們提出IRAK4 分子在APAP 誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷中可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。