左婕，費(fèi)燁，李佳慧，肖怡，王筑婷，許慶忠，李紅梅

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）已成為威脅全球健康的最常見的慢性代謝性疾病，其特征是胰島素抵抗和相對胰島素不足[1]。國際糖尿病聯(lián)合會（International Diabetes Federation，IDF）估計(jì)，2019 年全球糖尿病患病率為9.3%（4.63億人），到2030年將增加到10.2%（5.78億人），到2045年將增加到10.9%（7億人）[2]。T2DM患者發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險增加，包括大血管并發(fā)癥（心血管疾?。┖臀⒀懿l(fā)癥（腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變）[3]。近年來，在糖尿病防治和血糖管理領(lǐng)域取得巨大的進(jìn)步，但并發(fā)癥的患病率仍然是T2DM患者面臨的一個重要問題[4]。目前，還沒有治愈糖尿病的藥物，T2DM的首選治療方法包括使用降糖藥物（如雙胍類、磺脲類藥物等）和生活方式干預(yù)（健康營養(yǎng)和日常體力活動）。

近年來，新的天然化合物以其高效、來源廣泛、價廉、無副作用等特點(diǎn)在治療T2DM方面取得了重大的進(jìn)展[5-7]。在這些化合物中，從食品蛋白中提取的天然活性肽因其具有多種生物活性和較高的安全性而受到眾多研究人員的關(guān)注?？嗍w是一種獨(dú)特的食藥兩用糧食作物，因其具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，越來越受到人們的重視[8]?？嗍w活性肽P3（P3肽）是一個由5個氨基酸（Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp）組成的具有抗氧化活性的小肽，是課題組前期通過堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白分離純化得到的，其分子量大小為741.8 Da[9]。P3肽穩(wěn)定性好，活性受外界環(huán)境影響小，而且沒有毒性作用[10]。本研究觀察P3肽在體外對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并在鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）誘導(dǎo)糖尿病小鼠動物模型的基礎(chǔ)上，探討P3肽對糖尿病小鼠的影響，為P3肽進(jìn)一步的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只SPF級C57/BL6雄性小鼠：體重為18g～20g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號為SYXK（黔）-0001。

1.1.2 試劑

P3肽（色譜純）：上海淘普生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（分析純）：美國Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；吡格列酮（分析純）、BCA蛋白定量試劑盒：北京Solarbio公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B[p-Akt（Ser473）]、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter 4，GLUT4）、胰島素底物受體 1（insulin recptor substrate-1，IRS1）、β-肌動蛋白（β-actin）：武漢Proteintech公司；磷酸化胰島素底物受體1[p-IRS1（Ser307）]：美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG：美國Jackson Immuno-Research公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

血糖儀（安穩(wěn)型）、血糖試紙（Ⅰ型）：長沙Sannou公司；多功能酶標(biāo)儀（H4）、凝膠成像儀（Gel Doc XR）：美國Bio-Tek公司；臺式離心機(jī)（TGL-16B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平（CP214）：奧豪斯儀器有限公司；蛋白垂直電泳儀（DYCZ-24D）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-6C型）：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)

設(shè)置空白背景組、空白組、樣品背景組、樣品組，在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以P3肽為抑制劑，樣品組和樣品背景組每組 P3 肽濃度依次為 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 mg/mL，α-葡萄糖苷酶濃度為 0.8 U/mL。相應(yīng)試劑的添加順序見表1。加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）、P3 肽、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）和α-葡萄糖苷酶進(jìn)行反應(yīng)；碳酸鈉終止反應(yīng)后，在波長405 nm處測定吸光度。按照計(jì)算公式計(jì)算抑制率。

表1 α-葡萄糖苷酶體外抑制實(shí)驗(yàn)Table 1 Inhibition of α-glucosidase in vitro μL

1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立

糖尿病小鼠模型參加文獻(xiàn)[11]的方法建立并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。準(zhǔn)備5周齡的C57/BL6雄性小鼠?；A(chǔ)飼料中加入20%蔗糖和10%豬油配制成高熱量飼料。高熱量飼料喂養(yǎng)小鼠4周后，空腹注射STZ。按照50 mg/kg STZ劑量連續(xù)3 d腹腔注射。一周后，小鼠尾靜脈取血，使用血糖儀測小鼠空腹8 h的血糖濃度。若血糖濃度大于7 mmol/L，即糖尿病模型建造成功。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與藥物干預(yù)

選取正常小鼠10只，建模成功糖尿病小鼠50只，分為空白組、模型組、陽性藥物組（每天吡格列酮20 mg/kg灌胃）、P3肽低劑量組（P3肽5 mg/kg每日腹腔注射，簡寫成低-P3）、中劑量組（P3肽10 mg/kg每日腹腔注射，簡寫成中-P3）、高劑量組（P3肽20 mg/kg每日腹腔注射，簡寫成高-P3）?？瞻捉M給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組和各藥物組高熱量飼料喂養(yǎng)，藥物干預(yù)4周。

1.3.4 糖耐量實(shí)驗(yàn)

給藥干預(yù)4周后，口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test,OGTT）法檢測每組小鼠糖耐量情況。每組小鼠斷食不斷水8 h，精準(zhǔn)稱取各組小鼠體重，葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃。然后血糖儀測量0、30、60、120、180 min的小鼠尾尖血，記錄數(shù)值。

1.3.5 小鼠血脂檢測

藥物干預(yù)4周后，空腹處理各組小鼠8 h。取小鼠眼球血3 500 r/min離心10 min，收集上清液。按照葡萄糖、血脂測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，測量血清葡萄糖、TG、TC、LDL-C和HDL-C。

1.3.6 檢測胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

藥物干預(yù)4周后，處死各組小鼠，取小鼠肝臟，然后稱取100 mg肝臟組織進(jìn)行蛋白提取。將稱取的肝臟組織置于玻璃勻漿器中，每管加入300 μL組織裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、150 mmol/L NaCl、1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40）、0.1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）]，并加入 3 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和3 μL蛋白磷酸酶抑制劑。冰上研磨裂解20 min，收集勻漿于EP管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品30 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗 IRS1、Akt、PI3K、GLUT4、p-IRS1、p-Akt抗體孵育。洗滌后根據(jù)上述蛋白的一抗種屬選擇加入相應(yīng)的羊抗兔或羊抗鼠二抗。孵育、洗滌后與發(fā)光液避光充分反應(yīng)，曝光后掃描，用Image J 1.5.2進(jìn)行光密度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析對多組進(jìn)行比較，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 P3肽對α-葡萄糖苷酶活性的影響

體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶可水解碳水化合物中的葡萄糖苷鍵，釋放葡萄糖。抑制α-葡萄糖苷酶活性可減緩餐后血糖的升高。采用不同濃度的P3肽作用于α-葡萄糖苷酶，結(jié)果見圖1。

圖1 P3肽對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 The effect of peptide P3 onα-glucosidase activity

由圖1可知，給予P3肽干預(yù)后，與空白組對比，各組α-葡萄糖苷酶活性降低，差異極顯著（P＜0.01）。并且P3肽濃度為0.25 mg/mL～8.00 mg/mL時，隨著P3肽濃度的升高，α-葡萄糖苷酶活性逐漸降低。在P3肽濃度為1.00 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率可以達(dá)到50%。結(jié)果顯示P3肽可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

2.2 P3肽對糖尿病小鼠糖耐量的影響

OGTT在臨床上常被用于檢測有無糖代謝異常。藥物干預(yù)4周后，OGTT法檢測各組小鼠糖耐量，記錄0、30、60、120、180 min 血糖變化，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組小鼠糖耐量曲線下行面積（area under curve，AUC），結(jié)果見圖2。

圖2 苦蕎活性肽P3對C57/BL6糖尿病小鼠糖耐量的影響Fig.2 Effect of peptide P3 on glucose tolerance C57/BL6 diabetic mice

由圖2A可知，模型組0～180 min內(nèi)各時間點(diǎn)血糖值均高于空白組；陽性藥組以及P3肽組0～180 min內(nèi)各時間點(diǎn)血糖均低于模型組。如圖2B所示，相對于空白組，模型組糖耐量升高，差異極顯著（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組小鼠糖耐量顯著改善（P＜0.05）；P3肽組小鼠中劑量組的糖耐量顯著改善（P＜0.05），高劑量組的糖耐量得到明顯改善，差異極顯著（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明通過腹腔注射P3肽可以明顯改善糖尿病小鼠糖耐量異常的情況。

2.3 P3肽對糖尿病C57/BL6小鼠血糖的影響

空腹血糖是臨床上糖尿病最常見的檢測指標(biāo)，可反映胰腺β細(xì)胞功能，一般代表基礎(chǔ)胰島素的分泌功能。給藥干預(yù)4周后，空腹處理各組小鼠8 h。取小鼠眼球血，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，按照葡萄糖測定試劑盒說明書檢測各組小鼠血糖含量，結(jié)果見圖3。

圖3 苦蕎活性肽P3對C57/BL6糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.3 Effect of peptide P3 on fasting blood glucose C57/BL6 diabetic mice

由圖3可知，與空白組相比，模型組小鼠空腹血糖升高，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥物組小鼠空腹血糖顯著下降（P＜0.05），P3肽組小鼠中劑量組、高劑量組的空腹血糖下降尤為明顯，差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明P3肽具有改善C57/BL6糖尿病小鼠高血糖的作用。

2.4 P3肽對糖尿病C57/BL6小鼠血脂的影響

胰島素抵抗及糖尿病發(fā)展過程中常伴隨著血脂代謝紊亂。按照各血脂測定試劑盒說明書檢測各組小鼠 TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量，結(jié)果見圖4。

圖4 P3肽對C57/BL6糖尿病小鼠血脂的影響Fig.4 Effect of peptide P3 on blood lipid in C57/BL6 diabetic mice

由圖4可知，與空白組相比，模型組小鼠TG、TC明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）；LDL-C 顯著升高（P＜0.05），HDL-C 明顯降低，差異極顯著（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組TG明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），P3肽組小鼠低劑量組TG顯著降低（P＜0.05），中劑量組、高劑量組TG明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），呈劑量依賴性；與模型組相比，陽性藥物組TC顯著降低（P＜0.05），P3肽組小鼠中劑量組 TC 顯著降低（P＜0.05），高劑量組TC明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），呈劑量依賴性；相對模型組，陽性藥物組LDL-C顯著降低（P＜0.05），P3肽組小鼠低劑量組、高劑量組LDL-C明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），中劑量組LDL-C顯著降低（P＜0.05）；相對模型組，陽性藥物組HDL-C明顯升高，差異極顯著（P＜0.01），P3肽組小鼠低劑量組、高劑量組HDL-C顯著升高（P＜0.05），中劑量組HDL-C明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表示P3肽具有改善糖尿病小鼠血脂代謝異常的作用。

2.5 P3肽對糖尿病C57/BL6小鼠肝臟組織胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)通過多種胰島素信號通路發(fā)生，其中，PI3K/Akt在胰島素的代謝中起著重要的作用。本研究采用Western blotting檢測了小鼠肝組織中PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖5。

圖5 苦蕎活性肽P3對C57/BL6糖尿病小鼠肝臟胰島素信號通路相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effect of peptide P3 on insulin signal pathway related proteins in liver of C57/BL6 diabetic mice

由圖5可知，各組小鼠肝臟組織IRS1、Akt表達(dá)均無明顯差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠肝臟組織 p-IRS1（Ser307）水平升高，差異極顯著（P＜0.01）；而PI3K、GLUT4的表達(dá)明顯下調(diào)，差異極顯著（P＜0.01），p-Akt（Ser473）水平降低，差異極顯著（P＜0.01）。說明C57/BL6糖尿病小鼠的肝臟組織胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)受阻，形成了胰島素抵抗。經(jīng)藥物干預(yù)后，相對模型組，陽性藥物組p-IRS1（Ser307）水平明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），P3肽組小鼠低劑量組p-IRS1（Ser307）水平顯著降低（P＜0.05），中劑量組、高劑量組的p-IRS1水平明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），呈劑量依賴性；相對模型組，P3肽各劑量組小鼠肝組織中PI3K表達(dá)上調(diào)，差異極顯著（P＜0.01）；相對模型組，P3肽各劑量組小鼠肝組織中GLUT4表達(dá)上調(diào)，差異極顯著（P＜0.01），呈劑量依賴性；相對模型組，P3肽組小鼠中劑量組、高劑量組的p-Akt（Ser473）水平升高，差異極顯著（P＜0.01），呈劑量依賴性。結(jié)果表明P3肽具有介導(dǎo)C57/BL6糖尿病小鼠肝臟組織胰島素信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善胰島素抵抗的作用。

3 討論與結(jié)論

糖尿病是一種以高血糖為主要臨床表現(xiàn)的慢性疾病，其特征是機(jī)體不能產(chǎn)生胰島素（1型糖尿病）或胰島素作用缺陷（2型糖尿?。12]。肥胖、高脂血癥和炎癥等代謝紊亂常伴隨糖尿病的發(fā)生[13-14]。

餐后血液中葡萄糖的主要來源之一是吸收從碳水化合物中消化的葡萄糖[15]。通常食物中的碳水化合物會被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等消化酶水解為葡萄糖后被機(jī)體吸收[16]。研究報道，來源于各種食物蛋白的生物活性肽可抑制水解碳水化合物的消化酶，這是控制餐后高血糖的有效策略[17]。本研究中P3肽在體外可明顯抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可能具有降低餐后血糖的能力。但是P3肽的序列中有被胰蛋白酶識別并水解的賴氨酸，如果口服P3肽，可能會在腸道中被水解而失去其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。因此，本研究采用腹腔注射P3肽，以觀察它對糖尿病小鼠的作用。

本研究通過高熱量飲食及注射STZ誘導(dǎo)形成T2DM糖尿病小鼠模型，連續(xù)給予P3肽干預(yù)4周，觀察P3肽對糖尿病小鼠糖耐量、血糖及血脂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P3肽可減輕糖尿病小鼠的葡萄糖耐量、降低血糖、改善血脂紊亂。胰島素抵抗（insulin resistance,IR）即胰島素敏感性降低，是導(dǎo)致T2DM的主要原因。改善肝臟IR被認(rèn)為是治療T2DM的重要途徑。葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)通過各種胰島素信號途徑進(jìn)行，其中包括PI3K、Akt和GLUT4等蛋白質(zhì)組成的PI3K/Akt/GLUT4的信號通路與葡萄糖的吸收和代謝密切相關(guān)[18]。GLUT4是一個含有跨膜域的蛋白質(zhì)，靜息狀態(tài)下，GLUT4位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)血糖水平升高，胰島素結(jié)合并激活胰島素受體，促進(jìn)IRS1的酪氨酸磷酸化，從而激活PI3K和Akt，激活的PI3K/Akt促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取，并最終降低血糖水平[19-20]。研究認(rèn)為IR的形成主要是由于胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，或者通路中關(guān)鍵蛋白作用減弱而使胰島素不能發(fā)揮其正常的生理作用[21]。IRS1蛋白的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化被認(rèn)為是IR的分子基礎(chǔ)[22-23]，IRS1的絲氨酸磷酸化，特別是Ser307和Ser636/639上的絲氨酸磷酸化后，可抑制IRS1的酪氨酸磷酸化[24]。在本研究中，P3肽可逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠肝臟組織中的IRS1蛋白Ser307磷酸化水平的升高、調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活PI3K/Akt信號通路增加GLUT4的表達(dá)，從而增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，P3肽可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低糖尿病小鼠血糖、改善糖尿病小鼠的糖耐量和血脂紊亂，通過抑制IRS1蛋白Ser307磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，增加GLUT4的表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取，從而改善IR。P3肽可用于防治糖尿病的藥物開發(fā)。