董曉慧，李賀，王可答，王翠玲，姜輝，單大鵬，金振國

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院，黑龍江 綏化 152000；2.綏化學(xué)院農(nóng)業(yè)與水利工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152000；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150000；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

玉米作為世界上種植最廣泛的谷物之一，每年生產(chǎn)量超10 億噸。玉米籽粒品種可根據(jù)成熟時籽粒的外觀主要分為硬粒型和馬齒型。玉米籽粒因質(zhì)地不同其用途也會有所不同。玉米除作為世界范圍內(nèi)廣泛消費的主食外，其另一個主要用途是生產(chǎn)淀粉和淀粉衍生產(chǎn)品，例如葡萄糖漿和乙醇（生物燃料），同時作為動物飼料被廣泛使用[1-3]。玉米籽粒主要由三部分組成：果皮、胚和胚乳。其中，玉米的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值主要來自于胚乳，它也是玉米籽粒最主要的組成部分，占干重的80%～85%[4-5]。谷物中細(xì)胞壁多糖（cell wall polysaccharides，CWP）僅占5%～10%。CWP 在數(shù)量、組成和結(jié)構(gòu)上具有很大的多樣性。例如谷物果皮中富含細(xì)胞壁，而胚乳只含有少量的細(xì)胞壁，胚乳中CWP 含量較低，但因其水溶性、黏度和凝膠特性等功能較好，所以CWP 對食品加工、人類健康和動物營養(yǎng)的研究均具有較大的影響。在玉米籽粒中，多數(shù)關(guān)于CWP 的研究都集中在果皮，它在碾磨副產(chǎn)品（麩皮、玉米纖維膠）或玉米蒸煮廢水中大量存在。這些副產(chǎn)物的主要成分是復(fù)雜的木聚糖，并且其中主鏈的木糖單元被側(cè)鏈高度取代，這些側(cè)鏈主要由阿拉伯糖組成，也含有木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。因此，副產(chǎn)物統(tǒng)稱為異木聚糖（heteroxylans，HX）[6-9]。

目前，與關(guān)于水稻和小麥等谷物中CWP 的研究相比，玉米胚乳的CWP 很少受到關(guān)注。在玉米籽粒濕磨過程中，會分離出兩種纖維，即粗纖維和細(xì)纖維。其中，粗纖維主要來自于果皮，而細(xì)纖維主要來自于胚乳。從細(xì)纖維組分中分離出具有復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的HX，證實了玉米胚乳HX 的特性[10-13]。近幾十年來，細(xì)胞壁降解酶被用于改善谷物的性能，主要用于小麥、大麥或黑麥。這些酶制劑的特點是木聚糖酶活性高，盡管玉米中CWP 含量較低，但同樣能改善玉米的性能。因此，更好地了解玉米籽粒中的HX，對于了解酶解特性并使其在玉米營養(yǎng)應(yīng)用中的合理化使用至關(guān)重要。已有的研究表明[14-16]，玉米角質(zhì)和粉質(zhì)部分的蛋白質(zhì)組成存在一定關(guān)系，這可能表明其他晶粒組分，特別是CWP 的組成也可能存在異質(zhì)性。因此，為了更好地了解玉米中的細(xì)胞壁多糖，本文將從角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳中分離出細(xì)胞壁組分，并分析其異木聚糖的結(jié)構(gòu)表征，進而揭示細(xì)胞壁降解酶在玉米酶解中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試玉米：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院提供；角質(zhì)胚乳：將玉米顆粒通過處理去除胚芽和麩皮，并將角質(zhì)胚乳與其他部分分離，收集備用；粉質(zhì)胚乳：其作為粗粒生產(chǎn)線的副產(chǎn)品采集備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore-Q 密理博超純水儀：美國MILLIPORE 公司；VBF 型玉米脫胚機：佐竹機械（蘇州）有限公司；AZ100M 尼康多功能變焦顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司；G3S 形態(tài)粒度分析儀：馬爾文帕納科有限公司；Misonix Sonicator-4000 超聲儀：美國Misonix 公司；AL104 電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JULABO SW23 振蕩恒溫水浴槽：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；Optima XPN 超高速離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；Skalar San++連續(xù)流動分析儀：荷蘭Skalar分析儀器公司；NicoletiS50 傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PerkinElmer 氣相色譜儀：鉑金埃爾默股份有限公司；Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；C18 色譜柱（Lichrospher 100 RP-18e，5 μm，250 mm×4 mm）：德國默克集團；Dionex ICS 3000 離子色譜儀：美國戴安有限公司；Vario 元素分析儀：艾力蒙塔貿(mào)易（上海）有限公司；TGA 2050 TA 熱重分析儀：美國TA 儀器公司；AVANCEIII HD-400 液體超導(dǎo)核磁共振譜儀：美國布魯克道爾頓公司。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)粒度的測定

基于干法分析，使用特定的分散粉末（5 mg～20 mg），在30 ms 內(nèi)施加多個分散壓力（0.5、1.0、5.0 bar），然后沉降60 s?；诓煌耐干涔?、放大倍數(shù)、圖像之間重疊（40%）和142 個識別粒子的閾值，觀察并記錄4 個20 mm2的表面區(qū)域的分析結(jié)果。檢測記錄結(jié)束后，對記錄的圖像進行過濾與分析，以確定顆粒的形態(tài)特性以及相關(guān)的數(shù)量和體積分布。最后基于Morphologi 軟件分析出顆粒的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3.2 細(xì)胞壁組分的提取

將角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳的原始樣品進行過篩處理。該提取方法在角質(zhì)胚乳的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化[15]。為了更有效地去除淀粉和蛋白質(zhì)，分離出細(xì)胞壁中的所需組分，需經(jīng)過不同提取方法的優(yōu)化試驗，最終確定最佳方法。將400 g 角質(zhì)胚乳懸浮于2 L 的Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH7.8）中，該緩沖溶液含有150 mmol/L NaCl、2 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% Triton，并在4 ℃下振蕩1 h。將混合物高速離心（12 000 r/min、20 min）。過濾后將沉淀用離子水洗滌3 次，在室溫（20 ℃）下將其懸浮在1 L 的2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）中1 h，再次離心和過濾。用去離子水再次洗滌沉淀部分，將該組分懸浮在去離子水中并將pH 值調(diào)節(jié)至7，然后用蛋白酶（2 mL）在55 ℃下處理2 h 并過濾，然后在95 ℃下用耐高溫淀粉酶（800 μL）處理2 h，此時pH 值調(diào)節(jié)至6。將混合物熱洗兩次并過濾。在相同條件下進行淀粉的二次處理，以提高淀粉的溶解效果。固體部分用去離子水洗滌5 次，然后進行冷凍干燥以收集從角質(zhì)胚乳中得到的細(xì)胞壁組分（Vi-CW）。對于粉質(zhì)胚乳的提取，在SDS 步驟中使用超聲輔助處理，功率38 W，時間為1 min。為避免溫度過高應(yīng)將樣品置于冰浴中。后續(xù)步驟如上，最終收集從粉質(zhì)胚乳中得到的細(xì)胞壁組分（Fl-CW）。

1.3.3 異木聚糖的分離與純化

在95 ℃下從Vi-CW 和Fl-CW 中提取HX，在1.5 mmol/L 的KOH 溶液中提取2h。用鹽酸中和上清液，基于去離子水透析法處理后10 000 r/min 離心2 min，將上清液冷凍干燥。堿性提取物中的HX 可通過陰離子交換層析法進行純化，將100 mg 堿性提取物溶解在4 mL 去離子水中。以2 mL/min 的流速用去離子水（3倍柱體積）進行洗脫以回收未結(jié)合組分。結(jié)合部分的多糖用0～1 mol/L 的NaCl 溶液（3 倍柱體積）進行線性梯度洗脫。洗脫過程的監(jiān)測采用糖醛酸比色法測定。將梯度洗脫的組分濃縮，用去離子水透析法處理后冷凍干燥，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 細(xì)胞壁組分的酶解

將Vi-CW 和Fl-CW 懸浮在超純水中，并加入多酶制劑。在2 mL 懸浮液中HX 含量為10 mg，pH 值約為4.5，即在該酶制劑中主要存在的木聚糖酶的最佳pH值范圍內(nèi)[17]。對于10 mg HX，在1 U～10 U 范圍內(nèi)檢測酶活并進行優(yōu)化，最終確定5 U 即可達(dá)到溶解需求。因此，反應(yīng)培養(yǎng)基在40 ℃下加入5 U 酶制劑進行孵育12 h。通過離心（10 000 r/min、2 min）收集上清液，沸水浴5 min 使酶失活，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 理化特性的分析

基于2 mg 樣品與120 mg KBr 混合制成的KBr 顆粒進行傅立葉變換紅外吸收（Fourier transform infrared reflection，F(xiàn)TIR）光譜分析。光譜在4 000 cm-1～700 cm-1區(qū)域內(nèi)以2 cm-1的間隔透射模式進行測定。紅外光譜是由200 個干涉圖的共加產(chǎn)生的，基于軟件OPUS 7.0版對2 000 cm-1～700 cm-1區(qū)域內(nèi)的所有紅外光譜進行基線校正和單位矢量標(biāo)準(zhǔn)化。本文中所有獨立重復(fù)試驗次數(shù)均為3 次，且所有試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。用含有12.5 mmol/L 四硼酸鈉和18 mol/L 濃硫酸水解樣品后測定糖醛酸的含量，然后通過水解產(chǎn)物的衍生物進行比色。樣品在25 ℃下12 mol/L 硫酸溶液中預(yù)水解30 min，然后在100 ℃下1 mol/L 的硫酸溶液中水解2 h，以確定中性糖的組成。將水解后產(chǎn)物進行還原并乙?；笸ㄟ^氣相色譜法測定糖醇乙酸酯，并加入肌醇作為內(nèi)標(biāo)，使用DB225 色譜柱，以H2為載氣，溫度設(shè)定為205 ℃。考慮到樣品中的多糖形式，最終測定結(jié)果以無水糖表示。乙酰酯在0.5 mol/L NaOH 中脫酯化后，以異丙醇作內(nèi)標(biāo)基于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進行測定。在15 ℃恒溫條件下使用4 mmol/L 硫酸溶液以1 mL/min的流速進行洗脫。以3，4，5-三甲氧基-反式-肉桂酸作為內(nèi)標(biāo)物，阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）在2 mol/L NaOH 中脫酯后基于HPLC-DAD 法進行分析。用pH4.6 的乙腈/乙酸鹽緩沖液梯度洗脫，流速為1 mL/min?；诿绹治龌瘜W(xué)協(xié)會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）的檢測方法對淀粉進行定量。使用高效陰離子交換色譜-脈動電流探測法（high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）代替酶測定法進行葡萄糖的定量分析。配備CarboPac PA1 色譜柱，恒溫25 ℃，并以1 mL/min的流速用0.1 mol/L NaOH 進行洗脫。通過元素分析儀對所含氮進行測定，再進行換算得到蛋白質(zhì)的含量[18]?；曳植捎脽嶂胤治鰞x以10 ℃/min 的溫度速率升高直至550 ℃進行分析測定。

1.3.6 高效尺寸排阻色譜法

基于高效尺寸排阻色譜（high-performance size-exclusion chromatography，HPSEC）法分析分子量和特性黏度。將樣品溶解于0.05 mol/L 硝酸鈉溶液中，在沸水浴中加熱后過濾，吸取50 μL 樣液通過自動進樣器進樣，并在室溫（20 ℃）下以0.7 mL/min 的速率用0.05 mol/L 硝酸鈉溶液洗脫。折射率增量（dn/dc）為0.147 mL/g，使用軟件Omnisec 4.5 計算分子量以及特性黏度。

1.3.7 異木聚糖的結(jié)構(gòu)表征

基于已有研究[19]的基礎(chǔ)上改進甲基化方法測定單糖的組成。HX 樣品包括：粉質(zhì)胚乳中純化的異木聚糖（pFl-HX）、角質(zhì)胚乳中純化的異木聚糖（pVi-HX）和麩皮中提取的異木聚糖（Bran-HX）。將1 mg 干燥樣品溶解在1 mL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，加熱至80 ℃并保持該溫度直至樣品完全溶解。將溶液超聲2 min 后冷卻。將5%NaOH 加入到DMSO 溶液中，加入0.5 mL 碘甲烷后，將溶液渦旋并超聲10 min后逐步加入2 mL 去離子水以終止甲基化反應(yīng)。將2 mL 三氯甲烷加入溶液中，在8 000 r/min 條件下離心5 min。棄去水相，再洗滌有機相3 次，在每次渦旋和離心之前加入4 mL 去離子水。使有機相在室溫（20 ℃）下蒸發(fā)完全，然后用2 mol/L 三氟乙?；╰rifluoroacetyl，TFA）在120 ℃下水解2 h。將轉(zhuǎn)化后的糖醇乙酸酯通過氣相色譜法進行測定。將Bran-HX 作為對照組，并對溶解在重水中的HX 樣品進行1H-NMR 光譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同胚乳及其細(xì)胞壁組分的表征特性

角質(zhì)和粉質(zhì)胚乳及其細(xì)胞壁組分的形態(tài)粒度圖像見圖1。

圖1 角質(zhì)和粉質(zhì)胚乳及其細(xì)胞壁組分的形態(tài)粒度圖像Fig.1 Macroscope view of vitreous and floury endosperm and morpho-granulometric analysis of the extracted cell wall particles

角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳均來自于硬粒型玉米顆粒。由圖1A 可知，兩者均含有大量的單個淀粉粒和黑色簇狀的淀粉粒。只有角質(zhì)胚乳顯示出存在粗糙的顆粒，在377 nm 處的紫外觀察確定其為糊粉層碎片[20]。角質(zhì)胚乳、粉質(zhì)胚乳、Vi-CW 和Fl-CW 的化學(xué)組分見表1。

表1 角質(zhì)胚乳、粉質(zhì)胚乳、Vi-CW 和Fl-CW 的化學(xué)組分Table 1 Chemical components of vitreous endosperm，floury endosperm，Vi-CW and Fl-CW%

由表1 可知，對于角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳總糖的質(zhì)量百分比分別為95.7%和81.6%。通過Triton 和SDS兩個預(yù)處理步驟，使用蛋白酶進行一次處理和耐高溫淀粉酶兩次連續(xù)處理，以達(dá)到去除蛋白質(zhì)和淀粉的目的。通過計算可知，來自角質(zhì)胚乳的細(xì)胞壁部分（Vi-CW）和來自粉質(zhì)胚乳的細(xì)胞壁部分（Fl-CW）的產(chǎn)率分別為1%和3%。從粉質(zhì)胚乳中提取的細(xì)胞壁組分雖然比角質(zhì)胚乳的產(chǎn)率高，但與從其他谷物（小麥、黑麥或大麥）中提取相比仍然具有一定的困難。這可能是玉米胚乳中細(xì)胞壁的含量較低或角質(zhì)胚乳的致密性導(dǎo)致的。

基于已有研究，在玉米麩皮中描述的HX 成分分析，HX 含量計算為阿拉伯糖、木糖和半乳糖的總和[21-22]。在比較不同樣品中HX 的含量時，HX 只占原材料的較小部分，并且在粉質(zhì)胚乳（2.5%）中含量比在角質(zhì)胚乳（0.7%）中更高，說明其含量在粉質(zhì)胚乳細(xì)胞壁中較高。角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳中Ara/Xyl 的值分別為1 和1.1。這與已有相關(guān)研究[8]的從19 株玉米籽粒中手工分離得到的胚乳組織中糖醛酸的平均含量為1.1%和Ara/Xyl 比值為1.2 的分析結(jié)果基本吻合。少量Rha 的存在說明胚乳也含有半乳糖醛酸，并在細(xì)胞壁中形成少量的果膠。表1 中所示的糖醛酸含量包括半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，因此在計算細(xì)胞壁中的HX 含量時并未考慮兩者的含量。在角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳中蛋白質(zhì)含量相當(dāng)。為了能夠更好地提取HX 應(yīng)盡可能多地去除蛋白質(zhì)和淀粉。

2.2 Vi-CW 和Fl-CW 的理化特性

通過3 種不同分散壓力測定Vi-CW 和Fl-CW 的顆粒形態(tài)。此檢測技術(shù)可對每個粒子進行詳細(xì)分析，進而對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)合圖1B 可知，每次分析觀察到的粒子數(shù)量在5.5 萬～42.0 萬。可觀察到Vi-CW 和Fl-CW 兩者均帶有明顯的粗顆粒和細(xì)顆粒。Vi-CW 和Fl-CW 的形態(tài)粒度參數(shù)見表2。

表2 Vi-CW 和Fl-CW 的形態(tài)粒度參數(shù)Table 2 Morphological granularity parameters of Vi-CW andFl-CW

由表2 可知，盡管兩者經(jīng)過相同的理化處理，但是平均直徑d（1，0）略有不同。Vi-CW 的平均直徑小于Fl-CW，當(dāng)分散壓力增加到5.0 bar 時平均直徑明顯下降。尤其是對于含有較大顆粒的Fl-CW，其直徑下降了30%，而Vi-CW 的直徑下降了20%。雖然兩者體積分布的平均直徑d（4，3）幾乎無差別，但這與分散壓力無關(guān)。Vi-CW 和Fl-CW 的數(shù)量分布與體積分布見圖2。

圖2 的分布曲線表明，細(xì)顆粒是受分散條件影響的主要物質(zhì)。觀察到縱橫比接近0.65，所以可以評估出其約為“球體”模型，通過每個粒子的周長和面積可計算出比表面積。總交換表面可以通過細(xì)顆粒在0.5 bar條件下的平均比表面積來估算，可觀察到Fl-CW 的比表面積小于Vi-CW。

Vi-CW 和Fl-CW 的化學(xué)組分還包括中性糖和酸性糖、香豆酸和阿魏酸、乙酰基和蛋白質(zhì)。葡萄糖仍然存在于兩者之中，但是考慮到Vi-CW 和Fl-CW 的產(chǎn)率，基于初始胚乳換算后Vi-CW 和Fl-CW 中存在的葡萄糖含量分別為0.06%和0.10%，這體現(xiàn)了淀粉酶處理的效率較好，說明99.9%的淀粉已被除去。在Fl-CW 中未檢測到殘留的淀粉，而在Vi-CW 中仍有少量殘留的淀粉，表明該細(xì)胞壁部分含有混合鍵β-葡聚糖[23]。Vi-CW 的HX 含量為21.8%，幾乎達(dá)到了Fl-CW（43.1%）的一半，但HX 在Fl-CW 中的分離率更高。以木糖含量為基礎(chǔ)，分別計算阿拉伯糖、木糖和半乳糖的摩爾比，此可作為HX 化學(xué)結(jié)構(gòu)的指標(biāo)。Vi-CW 的值分別為0.87、1.00 和0.14；Fl-CW 的值分別為0.93、1.00 和0.13。兩者的木糖和半乳糖的數(shù)值接近，F(xiàn)l-CW 中阿拉伯糖比Vi-CW 高，因此兩者的HX 之間側(cè)鏈分布會略有不同。由表1 還可知，在Vi-CW 和Fl-CW 中糖醛酸含量分別為4.2%和5.8%，說明葡萄糖醛酸與HX 的側(cè)鏈有關(guān)。然而，少量鼠李糖的存在說明存在果膠，從而伴隨著半乳糖醛酸的存在。而阿魏酸基本上均與HX的阿拉伯糖殘基相關(guān)[4，8]。乙酰基的存在說明在木糖殘基上有支鏈。此外4 種待測樣品中均未檢測到香豆酸。

基于FTIR 光譜法對Vi-CW 和Fl-CW 進行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 Vi-CW 和Fl-CW 的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of the Vi-CW and Fl-CW

由圖3 可知，在1 045 cm-1處的峰表明C-O 和CC 的拉伸，并且HX 的糖苷鍵（C-O-C）可由1 260 cm-1處的條帶表示。由（C=O，N-H）和（C-N，N-H）鍵導(dǎo)致的在1 550 cm-1和1 655 cm-1處的吸收可歸因于蛋白質(zhì)的存在，并證實了蛋白質(zhì)在提取過程中沒有被完全消除。在1 655 cm-1處，F(xiàn)l-CW 的蛋白峰強度比Vi-CW 低很多，說明Fl-CW 的蛋白質(zhì)含量更低。在1 452、1 382、1 329 cm-1和1 260 cm-1處的4 個小峰代表了C-H 和C-O 的彎曲或拉伸作用。在1 750 cm-1和1 260 cm-1處可見的兩個尖銳峰可歸因于酯鍵作用，其可能與酚酯和乙?；拇嬖谟嘘P(guān)。盡管在預(yù)試驗中使用了不同去除蛋白質(zhì)的方法，但最佳處理方法仍會使Vi-CW 中含有超過31%的蛋白質(zhì)。這與紅外光譜分析結(jié)果一致。而對于Fl-CW 的蛋白質(zhì)去除效果更為明顯，其蛋白質(zhì)含量僅為7.3%。這意味著Fl-CW 的蛋白質(zhì)比Vi-CW的蛋白質(zhì)更容易被蛋白酶水解。

2.3 異木聚糖的分離與純化

不同異木聚糖的化學(xué)組成見表3。

表3 不同異木聚糖的化學(xué)組成Table 3 Chemical composition of different heteroxylan%

Vi-HX 和Fl-HX 分別表示從Vi-CW 和Fl-CW中分離得到的異木聚糖；pVi-HX 和pFl-HX 分別表示從Vi-CW 和Fl-CW 中分離并通過陰離子交換色譜法純化的異木聚糖。由表3 可知，基于優(yōu)化后的提取方法Fl-CW 的HX 產(chǎn)率高于Vi-CW。然而，阿拉伯糖、木糖和半乳糖的各自摩爾比，在Vi-HX 中分別為0.90、1和0.10；在Fl-HX 中分別為1.02、1 和0.12。此結(jié)果表明，分離出的聚合物組成接近但并不相同。通過對Vi-CW 和Fl-CW 中各摩爾比值的比較分析，可知在堿性分離過程中一部分半乳糖損失，特別是在Vi-HX 中，半乳糖和鼠李糖產(chǎn)率低于異木聚糖且損失占比相似，說明損失掉的鼠李糖和半乳糖來源于相同的多糖，據(jù)此可推斷出果膠可能被部分去除。所以，考慮到提取后異木聚糖中鼠李糖的含量較低，所以在表3 中糖醛酸被包含在異木聚糖的組分中。使用陰離子交換色譜法進一步純化的HX 化學(xué)組成，得到Vi-HX 和Fl-HX 的趨勢相似。以葡萄糖和游離糖醛酸組成的非結(jié)合組分分別占Vi-HX 和Fl-HX 負(fù)載材料的1.1%和2.2%。Vi-HX用0.2 mol/L 氯化鈉、Fl-HX 用0.15 mol/L 氯化鈉洗脫主要結(jié)合部分。由表3 中糖組分可知，純化后HX 中阿拉伯糖、木糖和半乳糖的各自摩爾比幾乎無變化，說明純化的HX 主要是在葡萄糖中被損失掉的。

2.4 pVi-HX 和pFl-HX 的結(jié)構(gòu)表征

pVi-CW 和pFl-CW 的HPSEC 譜圖見圖4。

圖4 pVi-CW 和pFl-CW 的HPSEC 譜圖Fig.4 HPSEC spectra of the pVi-CW and pFl-CW

如圖4 所示，高效尺寸排阻色譜顯示出pVi-HX和pFl-HX 這兩個純化組分的曲線相似，主峰在6.4 mL處洗脫。兩種組分都非常分散，在超過10 mL 時又出現(xiàn)了小峰。pVi-HX 和pFl-HX 的這些峰的固有黏度相似，分別為241 mL/g 和242 mL/g。結(jié)果表明，兩種多糖組分在溶液中的體積相似，高于先前報道的從玉米麩皮中提取的HX 值（170 mL/g～180 mL/g）[21]。

異木聚糖組分中存在的中性糖的糖苷鍵組成見表4。

表4 異木聚糖組分中存在的中性糖的糖苷鍵組成Table 4 Glycosidic-linkage composition of neutral sugars present in HX fractions

通過甲基化和1H-NMR 光譜法進一步分析pVi-HX 和pFl-HX 結(jié)構(gòu)的糖苷鍵組成，將玉米麩皮中分離的HX 作為對照組進行比較分析[24-25]。由表4 可知，多糖pFl-HX 和pVi-HX 表現(xiàn)出基于木聚糖復(fù)雜結(jié)構(gòu)的相似性，但在木聚糖主干的取代上卻存在差異性。由于pFl-HX 具有較高的Ara/Xyl 比值，因此未取代的1，4-木糖殘基的比例應(yīng)低于其他兩個樣品。pVi-HX和Bran-HX 均具有較低的Ara/Xyl 比值，這一特征可能是由于Vi-HX 單基取代木糖主鏈具有較高比例。然而，大部分木糖在Bran-HX 中被檢測為末端殘基，因此可能是單側(cè)鏈或更復(fù)雜的側(cè)鏈包括阿拉伯糖殘基。通過1，2-Ara、1，3-Ara 和1，5-Ara 殘基能夠證明阿拉伯糖對Bran-HX 中復(fù)雜側(cè)鏈的影響，而阿拉伯糖在pFl-HX 和pVi-HX 中基本以單末端殘基形式存在。除與木聚糖主要的鏈分布和阿拉伯糖取代相關(guān)的主要結(jié)構(gòu)特征外，1，2，4-鼠李糖通過甲基化分析證實了少量與pFl-HX 和pVi-HX 相關(guān)的果膠聚合物的存在。半乳糖被認(rèn)為是復(fù)合物HX 中短側(cè)鏈的末端殘基，所以僅在pVi-HX 中檢測到半乳糖的末端殘基，說明短的半乳糖鏈或作為果膠側(cè)鏈或作為HX 側(cè)鏈。

通過1H-NMR 光譜可進一步證實木糖主鏈的不同取代模式。5.1～5.6 范圍內(nèi)的峰主要對應(yīng)于在木糖骨架上分支的阿拉伯呋喃糖殘基的異頭質(zhì)子的化學(xué)位移。該區(qū)域顯示出的多個共振峰證明了取代模式的復(fù)雜性。Vi-HX 和Fl-HX 的核磁共振光譜雖然不相似但很接近，但與Bran-HX 光譜相比表現(xiàn)出明顯不同的特征。單個阿拉伯糖殘基在單/雙基取代木糖殘基上的異位質(zhì)子的化學(xué)位移如圖5 所示。

圖5 Bran-HX、pVi-CW 和pFl-CW 的1H-NMR 表征圖譜Fig.5 Characterisation of Bran-HX，pVi-CW and pFl-CW by 1H-NMR

由圖5 可知，基于位置2 或3 被阿拉伯糖連續(xù)取代木糖殘基，位置3 單基取代（5.38）的阿拉伯糖殘基的化學(xué)位移可上下移動[26-27]。因此，根據(jù)聚合物中阿拉伯糖連續(xù)取代木糖殘基的程度，在5.38 附近可觀察到峰展寬。在木糖殘基的位置2（5.21）和3（5.29）上作為雙取代存在的阿拉伯糖的異頭質(zhì)子也可觀察到類似的峰展寬。只有在5.38 處的峰值可以確定阿拉伯糖殘基在1，4-木糖殘基的位置3 上的單基取代。該峰值的相對比例在Vi-HX 中比在Fl-HX 中更明顯，而Bran-HX 中明顯最小，說明Bran-HX 中存在更復(fù)雜的分支模式和側(cè)鏈分布。在1H-NMR 光譜中Vi-HX 的1，3，4-木糖的比例較高，可得出單基取代率更高，此結(jié)果與甲基化結(jié)果一致。

2.5 細(xì)胞壁組分的酶解特性

通過木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶對分離的胚乳細(xì)胞壁進行降解，進一步研究玉米在高價值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化過程中胚乳細(xì)胞壁的酶降解特性，結(jié)果見表5。

表5 Vi-CW 和Fl-CW 中糖組分的酶促降解Table 5 Enzymatic degradation of sugar components in Vi-CW and Fl-CW

如表5 所示，降解后進行定量測定并分析其糖組分。對于Vi-CW 和Fl-CW 的可溶性總糖分別占原質(zhì)量的15.5%和40.8%，且對粉質(zhì)胚乳比角質(zhì)胚乳的作用更有效。通過形態(tài)粒度測定法確定的比表面積值表明Vi-CW 和Fl-CW 的值非常接近。可溶性糖含量與Vi-CW（21.8%）、Fl-CW（43.1%）中HX 的含量有關(guān)。這表明Fl-CW 中的HX 比Vi-CW 更容易被酶解。兩種組分的酶敏感性不同可能與化學(xué)結(jié)構(gòu)或HX 與各自細(xì)胞壁組分中其他組分的相互作用有關(guān)[28]。

Vi-CW 和Fl-CW 組分中大部分阿拉伯糖和木糖被溶解，這與結(jié)構(gòu)分析（甲基化和NMR）有關(guān)。結(jié)果表明，F(xiàn)l-HX 中單基取代和未取代木糖的比例高于Vi-HX，導(dǎo)致Fl-HX 更容易酶解。從Vi-CW 中溶解的半乳糖初始含量為71.2%，而半乳糖從Fl-CW 中則完全溶解（100%）。此結(jié)果說明Fl-CW 更易被降解，并且半乳糖取代物在Vi-CW 和Fl-CW 的HX 中位置不同，例如在Vi-HX 中僅存在1，4-半乳糖。阿魏酸和乙?；娜芙饴实陀谔穷?，這表明未降解部分比降解部分更富含這些取代基，因此這些取代基會導(dǎo)致部分HX難以水解[29-30]。本研究是在細(xì)胞壁上進行降解，而結(jié)構(gòu)分析是針對分離后的異木聚糖進行，或許會存在差異。然而，通過計算可知提取后異木聚糖的回收率達(dá)到了90%以上，確保了所研究的HX 代表了細(xì)胞壁中存在的HX。從角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳中分離出的HX存在輕微的結(jié)構(gòu)差異，涉及木糖單基取代率、側(cè)鏈中阿拉伯糖和半乳糖的含量以及半乳糖的位置，也能夠解釋酶制劑對粉狀胚乳效率較高的原因。

3 結(jié)論

本研究從玉米的角質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳中成功分離提取了異木聚糖組分，同時進行特性表征的分析，表明它們與麩皮中的HX 有所不同。因為Vi-HX 比Fl-HX 含有更多的單取代木糖，在角質(zhì)和粉質(zhì)胚乳的HX 中可觀察到支化度存在差異，而這些差異參與調(diào)節(jié)了每個組分的酶敏感性。由玉米胚乳中異木聚糖的結(jié)構(gòu)表征分析可知，酶制劑中添加的木聚糖酶和阿拉伯呋喃水解酶可能會提高木糖的產(chǎn)率。由于木糖更容易被腸道微生物群代謝，會對機體的生長性能產(chǎn)生有利影響。所以，本研究可有效靶向玉米顆粒的酶促降解，有助于酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用。