王輝，吳光浩，楊云龍，劉俊

(武漢大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，2口腔醫(yī)學(xué)院，3第一臨床學(xué)院，武漢 430071)

哺乳動(dòng)物優(yōu)質(zhì)卵子、受精卵和胚胎是胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及胚胎工程的重要研究對(duì)象。超數(shù)排卵是獲得大量的優(yōu)質(zhì)卵子、受精卵的有效方法之一。超數(shù)排卵簡(jiǎn)稱(chēng)超排，是通過(guò)外源性促性腺激素刺激哺乳動(dòng)物雌性個(gè)體，使募集的囊狀卵泡能同步發(fā)育成熟排卵[1]，最終獲得超過(guò)正常水平數(shù)倍卵母細(xì)胞。目前使用比較廣泛的是小鼠超排模型，使用孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）刺激小鼠卵巢超數(shù)排卵[2,3]。卵泡發(fā)育成熟后排卵，釋放出卵冠丘復(fù)合體，卵母細(xì)胞被透明帶和顆粒細(xì)胞包裹[4]。卵母細(xì)胞是最大的單個(gè)細(xì)胞，處在單倍體時(shí)期。透明帶是顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間一層折光性強(qiáng)的嗜酸性結(jié)構(gòu)，富含糖蛋白，由卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞共同分泌[5]。結(jié)構(gòu)疏松的顆粒細(xì)胞呈放射狀排列在透明帶表面形成放射冠。一致認(rèn)為最佳的卵母細(xì)胞形態(tài)是由均勻透明帶包圍的球形結(jié)構(gòu)，具有均勻的半透明細(xì)胞質(zhì)，不含內(nèi)含物和大小合適的極體[6]。

卵母細(xì)胞畸形非常普遍，在去除卵丘細(xì)胞后，大約 60%～70%的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出異常的形態(tài)特征[7]，形態(tài)評(píng)估可以很大程度上預(yù)測(cè)卵細(xì)胞的發(fā)育能力，當(dāng)卵冠丘復(fù)合體的形態(tài)呈現(xiàn)異常時(shí)，卵細(xì)胞發(fā)育能力較差，透明帶狀態(tài)是另外一種對(duì)卵細(xì)胞發(fā)育能力影響很大的胞質(zhì)外因素[8]。未經(jīng)任何處理的卵冠丘復(fù)合體直接在顯微鏡下觀察，卵母細(xì)胞連同周?chē)耐该鲙Ш头派涔诮Y(jié)構(gòu)觀察不夠清晰。本實(shí)驗(yàn)以小鼠超排模型為基礎(chǔ)，從輸卵管壺腹部取卵冠丘復(fù)合體，通過(guò)不同固定方法和染色方法，尋找最佳的卵母細(xì)胞及其周?chē)该鲙Ш头派涔谌旧椒?，便于更加清晰直觀觀察卵冠丘復(fù)合體形態(tài)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明（KM）小鼠，雌性，30 g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證編號(hào)SCXK（京）2019-0010。

2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素PMSG（寧波第二激素廠，110254564），人絨毛膜促性腺激素hCG（寧波第二激素廠，110251282），蘇木精染色液（BASO公司，BA-4041），伊紅染色液（BASO公司，BA-4024），PAS染色液（BASO公司，BA-4044），Masson染色液（BA-4079），95%乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10009164），無(wú)水乙醚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，80059618），丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10000418），4%多聚甲醛固定液（Biosharp公司，BL539A）。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

體視顯微鏡（尼康SMZ800N），正置顯微鏡（奧林帕斯BX53F），普通手術(shù)剪刀、鑷子、眼科剪等手術(shù)器械。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 超排卵

第1 d晚18點(diǎn)對(duì)超排組雌性KM小鼠腹腔注射0.2 mL的 50 IU/ml PMSG，空白組雌性KM小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水。48 h后，超排組雌鼠腹腔注射0.2 mL的50 IU/ml hCG，空白組雌鼠腹腔注射同劑量生理鹽水。62 h后，頸椎脫臼處死小鼠，體視顯微鏡下解剖輸卵管壺腹部，取卵冠丘復(fù)合體。

4.2 卵冠丘復(fù)合體固定方法

丙酮固定：丙酮固定5 s，自然揮發(fā)。

乙醚-95%乙醇固定：乙醚與95%乙醇液等比例混合（現(xiàn)配現(xiàn)用），固定10 s，自然揮發(fā)；

AF液固定：95%乙醇與40%甲醛 按照9:1比例混合，固定10 s，自然揮發(fā)；

多聚甲醛固定：4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗。

4.3 卵冠丘復(fù)合體染色方法

HE染色：蘇木精染色液染色5 min，水洗，鹽酸乙醇脫色5 s，水洗，伊紅染色液染色30 s，水洗；95%乙醇Ⅰ脫水2 min，95%乙醇Ⅱ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅰ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅱ脫水2 min；自然晾干后中性樹(shù)脂封片。

Masson染色：Weigert鐵蘇木素（A、B液等比例混合）滴染10 min，水洗，1%鹽酸乙醇脫色5 s，水洗，麗春紅酸性品紅溶液染10 min后水洗，磷鉬酸溶液處理5 min，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰乙酸溶液沖洗；95%乙醇Ⅰ脫水2 min，95%乙醇Ⅱ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅰ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅱ脫水2 min；自然晾干后中性樹(shù)脂封片。

PAS染色：高碘酸溶液滴染氧化10 min，蒸餾水沖洗，習(xí)夫（schiff）試劑滴染10 min，流水沖洗，蘇木素染液滴染2 min，流水沖洗；95%乙醇Ⅰ脫水2 min，95%乙醇Ⅱ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅰ脫水2 min，無(wú)水乙醇Ⅱ脫水2 min；自然晾干后中性樹(shù)脂封片。

結(jié)果

1 乙醚-95% 乙醇和4% 多聚甲醛固定卵冠丘復(fù)合體效果較好

采用丙酮作為固定劑時(shí)，HE染色后觀察到卵母細(xì)胞四周被大量顆粒細(xì)胞包裹著，顆粒細(xì)胞數(shù)量由近及遠(yuǎn)遞減，呈放射狀，卵母細(xì)胞體積是顆粒細(xì)胞數(shù)倍，顆粒細(xì)胞多呈紫紅色，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中間現(xiàn)無(wú)色透明帶，放射冠周邊少量淺紅色背景（圖1A）；Masson染色可觀察到一個(gè)紫紅色的細(xì)胞團(tuán)有著藍(lán)色背景，顆粒細(xì)胞呈暗紅色，無(wú)法清楚分辨卵母細(xì)胞和透明帶（圖1B）；PAS染色后可以觀察到紫紅色卵母細(xì)胞被藍(lán)色顆粒細(xì)胞包裹，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間紅色透明帶，細(xì)胞團(tuán)周?chē)兄鴾\紅色背景（圖1C）。

采用乙醚-95%乙醇作為固定劑時(shí)，HE染色可觀察到紫色細(xì)胞團(tuán)，無(wú)法區(qū)分卵母細(xì)胞、透明帶和顆粒細(xì)胞（圖1D）；Masson染色, 中間紅色卵母細(xì)胞被淺藍(lán)色圓環(huán)狀透明帶包圍，大量的紅色顆粒細(xì)胞分布在外層（圖1E）；PAS染色顯示紅色卵母細(xì)胞周?chē)粋€(gè)淺紅色圓環(huán)，顆粒細(xì)胞在淡紅色背景下呈放射狀排列在外層（圖1F）。

圖1 不同方法固定染色卵冠丘復(fù)合體效果比較。A，丙酮固定HE染色；B，丙酮固定Masson染色；C，丙酮固定PAS染色；D，乙醚-95%乙醇液固定HE染色；E，乙醚-95%乙醇液固定Masson染色；F，乙醚-95%乙醇液固定PAS染色；G，AF液固定HE染色；H，AF液固定Masson染色；I，AF液固定PAS染色；J，4%多聚甲醛液固定HE染色；K，4%多聚甲醛液固定Masson染色；L，4%多聚甲醛液固定PAS染色。比例尺，100 μmFig. 1 Comparison of the effects for different methods staining of the oocyte-corona-cumulus complex fixed by different fixation methods. A, HE staining after acetone fixation; B, Masson staining after acetone fixation; C, PAS staining after acetone fixation; D, HE staining after ether-95% ethanol fixation; E, Masson staining after ether-95% ethanol fixation; F, PAS staining after ether-95% ethanol fixation; G, HE staining after AF fixation; H, Masson staining after AF fixation; I, PAS staining after AF fixation; J, HE staining after 4% paraformaldehyde fixation; K, Masson staining after 4% paraformaldehyde fixation; L, PAS staining after 4% paraformaldehyde fixation. Scale bar, 100 μm

AF固定液固定時(shí)，HE染色顯示淺紅色卵母細(xì)胞形態(tài)不清晰，細(xì)胞核為藍(lán)色、胞質(zhì)為紅色的顆粒細(xì)胞圍繞在卵細(xì)胞周?chē)史派錉?，無(wú)透明帶（圖1G）；Masson染色顯示淺藍(lán)色背景下，紅色卵母細(xì)胞被紫紅色顆粒細(xì)胞包裹，二者之間存在無(wú)色透明圓環(huán)空隙，顆粒細(xì)胞呈放射狀排列（圖1H）；PAS染色顯示紅色卵母細(xì)胞周?chē)粋€(gè)淺紅色圓環(huán)，顆粒細(xì)胞在淡紅色背景下呈放射狀排列在外層（圖1I）。

以4%多聚甲醛作為固定劑時(shí)，HE染色顯示深藍(lán)色細(xì)胞團(tuán)無(wú)法區(qū)分卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和透明帶（圖1J）；Masson染色顯示藍(lán)色卵母細(xì)胞周?chē){(lán)色圓環(huán)，紫紅色顆粒細(xì)胞呈放射狀排列，包裹著卵母細(xì)胞和透明帶，結(jié)構(gòu)舒展，大量顆粒細(xì)胞散在（圖1K）；PAS染色顯示紫紅色卵細(xì)胞周?chē)蝗t色條帶，藍(lán)色顆粒細(xì)胞包裹在其周?chē)史派錉睿▓D1L）。

2 Masson染色和PAS染色對(duì)透明帶染色效果最佳

乙醚-95%乙醇固定后Masson染色顯示，藍(lán)色透明帶與卵母細(xì)胞融合，但與顆粒細(xì)胞邊界清晰（圖2A）。4%多聚甲醛固定后Masson染色顯示，藍(lán)色透明帶從卵母細(xì)胞到顆粒細(xì)胞，顏色由深到淺，且邊界清晰，其上出現(xiàn)藍(lán)色放射狀細(xì)絲（圖2B）。乙醚-95%乙醇固定后PAS染色顯示，淺紅色厚層在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間，無(wú)清晰界限（圖2C）。4%多聚甲醛固定后PAS染色顯示，紅色條帶緊貼在母卵細(xì)胞周?chē)?，靠近卵泡?xì)胞，顏色變淺，邊界模糊，放射狀紅色細(xì)絲（圖2D）。

圖2 不同方法固定后Masson和PAS染色透明帶效果比較。A，乙醚-95%乙醇固定Masson染色；B，4%多聚甲醛液固定Masson染色；C，乙醚-95%乙醇液固定PAS染色；D，4%多聚甲醛液固定PAS染色。比例尺，50 μm Fig. 2 Comparison of the effects of Masson and PAS stained zona pellucida after fixation with different methods. A, Masson staining after ether-95% ethanol fixation; B, Masson staining after 4% paraformaldehyde fixation; C, PAS staining after ether-95% ethanol fixation; D, PAS staining after 4% paraformaldehyde fixation. Scale bar, 50 μm

討論

1 固定方法比較

甲醛、丙酮、乙醇是目前常用的固定劑。甲醛通過(guò)醛基與氨基形成羧基結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)沉淀而進(jìn)行固定。甲醛穿透能力強(qiáng)，不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生收縮反應(yīng)，固定效果良好，是目前組織學(xué)中最常用的固定劑之一。丙酮為無(wú)色有機(jī)溶劑，滲透能力強(qiáng)，使蛋白質(zhì)沉淀[9]。乙醇通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)脫水變性和沉淀達(dá)到固定目的，但是乙醇使組織細(xì)胞脫水，且使細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象[10]。乙醇與乙醚按照一定比例混合能彌補(bǔ)單一使用乙醇的缺陷[11]。甲醛與乙醇按照一定比例混合可以減少乙醇對(duì)組織脆性的影響[12]。最終選擇用丙酮、4%多聚甲醛、乙醚-95%乙醇液混合液和AF液進(jìn)行固定。

4種固定劑對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定效果相差不大，但隨著固定劑極性越來(lái)越小，對(duì)隨卵冠丘復(fù)合體附帶的可溶性的輸卵管液體固定效果越來(lái)越好，所以丙酮固定后染色后，細(xì)胞團(tuán)均出現(xiàn)不同程度的不同顏色的背景。水溶性4%多聚甲醛固定劑稀釋輸卵管液，隨后在清洗4%多聚甲醛時(shí)而被清除，所以無(wú)法固定，所以細(xì)胞團(tuán)背景最干凈。

2 染色方法比較

蘇木素是堿性染料，主要染細(xì)胞核，伊紅是酸性染料，主要染胞質(zhì)。由于顆粒細(xì)胞胞體小，細(xì)胞核與蘇木素結(jié)合后，胞質(zhì)染色不明顯。透明帶未被染色，由于透明帶的存在導(dǎo)致染料進(jìn)入效果較差，影響卵母細(xì)胞顯色。PAS染液通過(guò)染粘液物質(zhì)中的氨基已糖和游離的己糖基，使粘液物質(zhì)呈紅色，可以使透明帶上糖蛋白染色呈紅色。4%多聚甲醛固定PAS染色，紅色透明帶清晰可見(jiàn)，但厚度較窄。乙醚-95%乙醇液混合液固定PAS染色，透明帶厚度較寬，但是顏色較淺，不利于觀察，所以4%多聚甲醛固定固定效果更好。Masson利用3種陰離子染料分子的大小和組織的滲透性能差異，把不同組織成分顯示出來(lái)，其中粘液呈藍(lán)色，細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，故而Masson染色能將具有疏松結(jié)構(gòu)的透明帶染藍(lán)色而與卵細(xì)胞和顆粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且Masson染色透明帶厚度較大呈現(xiàn)出來(lái)而便于觀察[13]。但是乙醚-95%乙醇固定Masson染色，顆粒細(xì)胞胞核未染色，而4%多聚甲醛固定Masson染色，顆粒細(xì)胞呈藍(lán)紫色，且透明帶透光性更好，所以4%多聚甲醛固定固定效果更好。4%多聚甲醛固定固定，與PAS染色相比，Masson染色透明帶與卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞色差明顯，且透明帶界限清晰，折光性更強(qiáng)，厚度較大，便于與觀察，所以Masson染色比PAS染色效果更好。

綜上所述，4%多聚甲醛固定和乙醚-95%乙醇混合固定液固定效果較好，Masson和 PAS染色透明帶效果更佳。4%多聚甲醛固定Masson染色效果最佳。