鄭偉，陳淑勤

（福建醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，2病理診斷中心，3腫瘤研究室，福州350004）

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜過程。在日常病理診斷及鑒別診斷中，比較常用的免疫組織化學(xué)Ki-67（細(xì)胞核陽(yáng)性）、CEA（細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性）、EMA（細(xì)胞膜/質(zhì)陽(yáng)性）等，以及酸性、中性黏液染色（AB-PAS），可用于判斷該腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后，以及鑒別胃癌細(xì)胞向胃、腸兩方向分化的特征等。以上染色，傳統(tǒng)的作法是各自分別呈現(xiàn)在不同的切片上，或有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白表達(dá)（單一定位）與特染進(jìn)行組合染色。為了更加直觀免疫組織陽(yáng)性表達(dá)與特殊染色（ABPAS）的關(guān)系，本文在胃腺癌同一張切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)與AB-PAS組合染色，觀察蛋白標(biāo)志物不同定位（細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜）與酸性、中性黏液成分形態(tài)學(xué)間相互關(guān)系。

材料與方法

1 材料

胃腺癌標(biāo)本，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，組織切片厚4 μm。

2 試劑

阿利辛藍(lán)（AB）染液( pH 2.5) 阿利辛藍(lán)8GS （Sigma）1.0 g，蒸餾水 97 mL，冰醋酸 3 mL， 麝香草酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）50 mg。1%過碘酸溶液：過碘酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1 g，蒸餾水100 mL。Schiff試劑：雙蒸水200 mL加熱到沸騰，加入堿性品紅（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1 g，攪拌，繼續(xù)煮至完全溶解；移開火源冷卻至50 ℃，加入1 mol/L鹽酸10 mL，混勻；待冷卻至35 ℃，加入偏重亞硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1 g，搖勻，避光冷藏12～24 h，溶液變?yōu)椴蔹S色時(shí)，加活性碳2 g，搖勻過濾于潔凈的磨沙口玻璃瓶?jī)?nèi)，蓋嚴(yán)，4 ℃保存。免疫組織化學(xué)試劑：鼠抗人單克隆第一抗體（即用型）包括抗Ki-67 (克隆號(hào)：SP6)、抗CEA（克隆號(hào)：MX068)和EMA（克隆號(hào)：E29)，ElivisionTM plus試劑盒（鼠/兔）（Kit-9902）和DAB Kit（20×）購(gòu)自福州邁新公司。

3 Ki-67、CEA或EMA免疫組織化學(xué)與AB-PAS組合染色

3.1 先免疫組織化學(xué)染色后AB-PAS染色

根據(jù)第一抗體的要求，對(duì)組織切片進(jìn)行相應(yīng)的抗原修復(fù)，冷卻至室溫后取出切片，自來(lái)水洗，PBS沖洗3 min×2，滴加3%H2O2室溫下孵育10min，阻斷過氧化物酶， PBS沖洗3 min×3；滴加抗Ki-67、CEA、EMA等即用型一抗，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 min×3；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育20 min，PBS沖洗3 min×3；滴加過氧化物酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3 min×3；滴加新鮮配制的DAB顯色，繼而蒸餾水浸洗1 min；先后滴加3%醋酸液2 min和阿利辛蘭染色液（pH 2.5）染色10～20 min；滴加3%醋酸分化液分化（必要時(shí)），流水沖洗；滴加1%過碘酸溶液于切片上10 min，自來(lái)水沖洗1 min，蒸餾水洗1 min；浸入Schiff試劑中，室溫避光染色5～15 min；自來(lái)水沖洗5 min，蒸餾水洗1 min；乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封固。

3.2 先AB-PAS染色后免疫組織化學(xué)染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗，按前述方法先行AB-PAS染色，蒸餾水洗1 min；對(duì)組織進(jìn)行相應(yīng)的抗原修復(fù)，冷卻至室溫后取出切片，自來(lái)水洗，PBS沖洗3 min×2，之后按照3.1中免疫組織化學(xué)染色操作步驟執(zhí)行，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封固。

結(jié)果

按3.1方法染色后，可見Ki-67、CEA和EMA免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物均呈棕褐色（圖1A—C），其中Ki-67陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞核（圖1A），CEA陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1B），EMA陽(yáng)性產(chǎn)物定位于胞質(zhì)和細(xì)胞膜（圖1C）。AB-PAS染色顯示胃黏膜中性黏液呈紫紅色，酸性黏液呈藍(lán)色（圖1）。 以上3組多重染色顯示各成分染色表達(dá)清晰。按3.2方法染色后，可見免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物CEA呈棕褐色，AB-PAS染色中性黏液脫色，酸性黏液呈藍(lán)色數(shù)量減少（圖1D）

圖1 胃腺癌組織Ki-67、CEA和EMA免疫組織化學(xué)染色與AB-PAS組合染色不同染色順序效果比較。A—C，先免疫組織化學(xué)染色后ABPAS染色；A，Ki-67免疫組織化學(xué)與AB-PAS組織化學(xué)組合；B，CEA免疫組織化學(xué)與AB-PAS組織化學(xué)組合；C，EMA免疫組織化學(xué)與AB-PAS組織化學(xué)組合。D，先AB-PAS染色后CEA免疫組織化學(xué)染色；比例尺，100 μmFig. 1 Comparison of Ki-67, CEA and EMA immunohistochemical staining combined with AB-PAS staining in different staining sequences in gastric adenocarcinoma. A to C, immunohistochemical staining followed by AB-PAS staining; A, Ki-67 immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry; B, CEA immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry; C. EMA immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry. D. AB-PAS staining followed by CEA immunohistochemical staining; scale bar, 100 μm

討論

Ki-67與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切聯(lián)系，目前常用來(lái)反映腫瘤細(xì)胞增殖活性，評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后。Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤細(xì)胞惡性程度越高。有研究顯示，Ki-67與胃腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后較差[1]。癌胚抗原（CEA）是一種酸性蛋白，在胃腸道腺癌中高表達(dá)，主要用于標(biāo)記上皮性腫瘤，尤其是腺上皮來(lái)源的腺癌，僅識(shí)別不典型增生及癌變組織的CEA。EMA是一組糖蛋白，廣泛分布在各種正常上皮細(xì)胞膜上及其腫瘤中，范圍與細(xì)胞角蛋白（CK）相似，但對(duì)內(nèi)臟腺上皮的表達(dá)優(yōu)于CK。

AB染液( pH 2.5) 用于顯示含唾液酸的上皮性黏液物質(zhì)，如腸道的杯狀細(xì)胞、唾液腺的黏液細(xì)胞，常應(yīng)用于腸型胃癌和胃型胃癌的鑒別診斷。中性黏液物質(zhì)含有氨基己糖和游離的己糖基，酸性黏液物質(zhì)也含有氨基己糖，并含有各種酸根。前者見于胃黏膜的表面上皮、十二指腸腺等；后者見于呼吸道和消化道的杯狀細(xì)胞等。胃黏膜表面上皮分泌中性黏液，而胃的腸腺化生或腸型胃癌的癌細(xì)胞分泌酸性黏液，但胃型胃癌的癌細(xì)胞則分泌中性黏液[2]。這兩種黏液在HE染色有時(shí)較難區(qū)別，但用愛爾新藍(lán)（pH2.5）-高碘酸-無(wú)色品紅法（AB-PAS）法則很容易區(qū)分中性黏液物質(zhì)和酸性黏液物質(zhì)。

免疫組織化學(xué)與特染的雙重染色技術(shù)已有報(bào)道[3、4]，本文分別探討了免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的表達(dá)與AB-PAS在胃腺癌標(biāo)本中的組合染色技術(shù)。結(jié)果表明，先行免疫組織化學(xué)染色再行AB-PAS染色，不影響組織內(nèi)中性、酸性黏液成分的顯示；經(jīng)AB-PAS復(fù)染后，也不影響免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物的顯示。免疫組織化學(xué)與特殊染色組合，要先進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，然后行特殊染色[5]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，DAB呈色的免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性定位不同的指標(biāo)與AB-PAS組織化學(xué)復(fù)染，鏡下形態(tài)均較直觀。由此提示免疫組織化學(xué)與特染組合方案可行與否，關(guān)鍵是不同陽(yáng)性表達(dá)的色彩要有反差，而與陽(yáng)性表達(dá)的位置關(guān)系不大。文獻(xiàn)中Ki-67與AB、SR的三重染色[5]，效果良好，也說(shuō)明色彩反差是考量選擇復(fù)染的原則。

本實(shí)驗(yàn)在操作中，AB染色時(shí)，如藍(lán)色過染可用3%醋酸分化背景；PAS染色Schiff試劑后流水沖洗會(huì)使紫紅色進(jìn)一步加深，這一步在顯微鏡下觀察如背景稍紅，可用95%酒精進(jìn)行分化。該組合染色，因蘇木素與阿利辛藍(lán)（AB）均呈藍(lán)色，故襯染細(xì)胞核步驟省略。

綜上所述，胃腺癌組織中先行免疫組織化學(xué)后與AB-PAS組合染色技術(shù)，在同一張切片觀察到不同的成分，形態(tài)直觀，可用于胃癌的鑒別診斷，是值得推廣的方法。