荊曉萌，顏嬌，李會(huì)敏，遲鑫明

（大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連116041）

甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤和最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，也是30年來全球范圍內(nèi)發(fā)病增長率最高的腫瘤[1]。根據(jù)腫瘤起源及分化差異，甲狀腺癌又可分為：甲狀腺乳頭狀癌 (papillary thyroid carcinoma, PTC)、甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma, FTC）、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）以及甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid Cancer, ATC）[2]。分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma, DTCs）包括PTC和FTC，約占甲狀腺惡性腫瘤的90%。分化型甲狀腺癌的特點(diǎn)是與無害的臨床過程相關(guān)，但少數(shù)病例可能表現(xiàn)出驚人的侵襲行為[3]。低分化甲狀腺癌（poorly differentiated thyroid cancer, PDTC）和ATC較罕見（分別為5%和1%），其侵襲行為和中位生存時(shí)間（分別為5年和6個(gè)月）較短。MTC占甲狀腺癌的5%，起源于濾泡旁C細(xì)胞[4]。

中國甲狀腺癌的發(fā)病率顯著上升[5]，且所有階段的甲狀腺癌數(shù)量都在增加[6]。其中發(fā)病率的上升幾乎完全是由于DTCs，特別是PTC診斷的增加。FTC、ATC和MTC的發(fā)病率在過去30年中保持相對(duì)穩(wěn)定[7]。

目前國內(nèi)外甲狀腺癌指南均建議，可利用分子標(biāo)志物檢測(cè)提高診斷準(zhǔn)確性[8]。因此我們希望找到甲狀腺癌分化相關(guān)的蛋白質(zhì)，作為臨床甲狀腺癌精準(zhǔn)分類的生物標(biāo)志物。

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，對(duì)細(xì)胞全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，從整體的角度分析細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律，以期更全面、高效的找到甲狀腺癌分化相關(guān)的生物標(biāo)志物[9]。

材料與方法

1 材料

細(xì)胞系THJ-16T、FTC133、Nthy-ori 3-1，購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection, ATCC）。培養(yǎng)條件：美國Gibco公司產(chǎn)RPMI Medium 1640basic (IX)培 養(yǎng) 基，SAGECREATION公司產(chǎn)10%進(jìn)口胎牛血清，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。I型膠原α1（collagen type I α1，COL1A）、硫氧化還原蛋白（thioredoxin, TRX）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1(Rho-associated protein kinase 1, Rock-1)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG均購于武漢三鷹（Proteintech）公司；角蛋白7（cytokeratin-7, KRT7）、角蛋白8（cytokeratin-8, KRT8）、I型膠原α2（collagen type I α2, COL1A2）、內(nèi)凹陷蛋白（caveolin-1, Cav-1）、纖維束蛋白同源物1（fascin 1, FSCN1）、高遷移率族蛋白A1（high mobility group protein A1, HMGA1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD2）均購于BIOWORLD公司。牛胰蛋白酶、尿素、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、甲醛（37%水溶液）、氘代甲醛（20%水溶液）、硼氫化鈉（NaBH3CN）、氘代硼氫化鈉（NaBH3CN）、甲酸（FA）購自Sigma Aldrich 公司；乙腈（色譜純）購自Merck公司；其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（Millipore, Milford, MA）純化。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

含10%進(jìn)口胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)THJ-16T、FTC133和Nthy-ori3-1細(xì)胞，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿的80%～90%，PBS沖洗，胰酶消化，離心后收取細(xì)胞，備用。

3 樣品處理、酶解和標(biāo)記

蛋白質(zhì)樣品的制備：將正常甲狀腺細(xì)胞系和甲狀腺癌細(xì)胞系分別用PBS清洗3遍，加入含有以下成分的細(xì)胞裂解液：8 mol/L尿素、50 mmol/L磷酸鹽 緩沖液（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT、0.2 mmol/L Na2VO4、1 mmol/L NaF和1%蛋白質(zhì)酶抑制劑。將此懸濁液在冰上超聲100 s，然后25000 g離心30 min，以除去細(xì)胞核等不溶雜質(zhì)，收集上清液，Bradford試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)溶于含8 mol/L尿素的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，56 ℃變性10 min，再加入100 mmol/L DTT，于56 ℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，加入20 μL 200 mmol/L IAA，在暗處反應(yīng)30 min。用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋后，按照蛋白質(zhì):酶為25:1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解24 h后，-80 ℃保存待用。

取THJ-16T、FTC133、Nthy-ori 3-1細(xì)胞的酶解產(chǎn)物各1 mg，分別加入1 mL以下同位素標(biāo)記溶液：2% CH2O - 0.3 mol/L NaBH3CN、2% CD2- 0.3 mol/L NaBH3CN2% CD2O - 0.3 mol/L NaDH3CN，室溫下反應(yīng)1 h。分別加入25%氨水20 μL反應(yīng)10 min，加入4% FA 50 μL調(diào)溶液至酸性。將標(biāo)記后的酶解產(chǎn)物等質(zhì)量混合后，用C18捕集柱脫鹽并冷凍干燥，-80 ℃保存待用。

4 納升級(jí)RPLC-ESI-MS/MS分析及數(shù)據(jù)處理

HPLC系統(tǒng)包括四元梯度泵（Thermo Fisher Scientific Inc., San Jose, CA, USA）、實(shí)驗(yàn)室自填裝的C18毛細(xì)管分離柱（75 μm i.d.×17 cm）以及反相捕集柱（150 μm i.d.×2 cm）；填料均為XBP-C18 硅球（5 μm, 120?，天津博納-艾杰爾科技有限公司）;流動(dòng)相分別為A（2% ACN/ 0.1% FA）和B（98% ACN/ 0.1%）。梯度設(shè)置如下：0% B（0 min）→0% B（20 min）→10% B（25 min）→40% B（175 min）→80% B（180 min）→80% B（190 min）；流量為200 nL/min。

LTQ-Orbitrap質(zhì)譜（Thermo Fisher Scientific Inc., San Jose, CA, USA）采用數(shù)據(jù)依賴模式，在正離子模式下進(jìn)行掃描，分辨率為60000；噴霧電壓為2.1 kV；離子傳輸毛細(xì)管溫度為250 ℃；質(zhì)譜掃描條件設(shè)定為質(zhì)荷比為300—1800的全掃描，并對(duì)其中的前15個(gè)最高峰進(jìn)行MS/MS掃描，二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量設(shè)定為35%，采用多重激發(fā)；中性丟失設(shè)置如下：為+1、+2、+3離子分別對(duì)應(yīng)于98.00、49.00、32.67Da。其中動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為：重復(fù)次數(shù)為1，重復(fù)容忍時(shí)間為30 s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60 s。每個(gè)樣品平行測(cè)試5次。

將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MASCOT （版本2.3.02）及Mascot Distiller針對(duì)IPI Mouse正反合庫數(shù)據(jù)庫（V. 201110）進(jìn)行搜索。肽段以胰酶完全酶解條件搜庫（最多容許兩個(gè)漏切位點(diǎn)）。允許的母離子質(zhì)量偏差為10 ppm，碎片離子質(zhì)量偏差為0.5 Da。搜庫時(shí)半胱氨酸殘基加烷基化固定修飾；可變修飾分別為：蛋氨酸殘基加氧化修飾，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上加磷酸化修飾。在要求蛋白鑒定P<0.05且至少含有一個(gè)鑒定到的可信肽段（bold red peptide）的前提下，將Ion score大于20的肽段用于定量，控制FDR<1%。

5 Western blot檢測(cè)

常規(guī)方法進(jìn)行Western blot，5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行分離，電泳儀電壓分別為80 V和120 V，三明治法350 mA恒流條件下轉(zhuǎn)模90 min，麗春紅染色。隨后將膜置于兔抗人COL1A1多克隆抗體（1:1000）、兔抗人COL1A2多克隆抗體（1:1000）、鼠抗人Cav-1單克隆抗體（1:1000）、兔抗人FSCN1多克隆抗體（1:1000）、兔抗人TRX多克隆抗體（1：1000）、兔抗人HMGA1多克隆抗體（1:1000）、兔抗人SOD2多克隆抗體（1:1000）、兔抗人Rock-1多克隆抗體（1:1000)、兔抗人KRT7單克隆抗體（1:1000）、兔抗人KRT8單克隆抗體（1:1000）、鼠抗人β-actin多克隆抗體（1:1000）孵育條件為4 ℃過夜，PBST洗膜5 min×3次后，置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG（1:2000）中室溫孵育90 min，PBST洗膜5 min×3次后，ECL孵育，凝膠成像儀（BIO-RAD, Universal Hood Ⅱ, USA）成像，應(yīng)用Image Lab軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析處理。

6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

使用北京中山金橋公司通用二步法試劑盒（小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。細(xì)胞爬片至70%密度時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定20 min；1% Tween 20室溫通透1 h，山羊血清37 ℃封閉30 min，PBS洗3遍；使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。鼠抗人COL1A單克隆抗體（1:500）、兔抗人TRX多克隆抗體（1:500）、兔抗人Rock-1多克隆抗體（1:500）4 ℃孵育過夜，反應(yīng)增強(qiáng)液室溫孵育20 min，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠/兔lgG聚合物室溫孵育20 min；1×DAB顯色劑（DAB底物液:濃縮DAB溶液=20:1）顯色7 min，蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸乙醇、氨水沖洗返藍(lán)，脫水透明后封片，顯微鏡觀察、拍照。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行顯微圖像分析，以陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物平均積分光密度（average integrated optic density, Average IntDen）代表免疫反應(yīng)性強(qiáng)度。

7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有除免疫細(xì)胞化學(xué)以外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS16軟件進(jìn)行方差分析，免疫細(xì)胞化學(xué)染色定量分析使用Graphpad Prism 7.0軟件完成，采用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 正常甲狀腺細(xì)胞系與中低分化甲狀腺癌細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)

通過Fold change和P-Value兩個(gè)指標(biāo)篩選蛋白質(zhì)后，取t檢驗(yàn)具有顯著性差異（P<0.05）、且蛋白表達(dá)量變化1.5倍及以上的蛋白作為差異蛋白，分別篩選出甲狀腺癌低分化細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白101個(gè)；中分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白103個(gè)；低分化與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間有顯著差異表達(dá)的蛋白106個(gè)（圖1）。

2 正常甲狀腺細(xì)胞系與中、低分化甲狀腺癌細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)關(guān)系

對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞系與中、低分化甲狀腺癌細(xì)胞系間差異表達(dá)蛋白分析表明：低分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中有38個(gè)蛋白質(zhì)與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系間差異表達(dá)蛋白質(zhì)相重疊，有63個(gè)蛋白質(zhì)與低分化與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)相重疊；中分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系間差異表達(dá)蛋白質(zhì)有53個(gè)與低分化與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)相重疊（圖2）。部分差異表達(dá)蛋白具體名稱見表1。

表1 部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息Tab. 1 Partial information of differentially expressed proteins

圖l 正常甲狀腺細(xì)胞系與中、低分化甲狀腺癌細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)火山圖法分析。A，低分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系；B，中分化甲狀腺癌細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系；C，低分化甲狀腺癌細(xì)胞系與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系。Fig. 1 Analysis of differentially expressed proteins between normal and moderately and/or poorly differentiated thyroid cancer cell lines by volcanic map. A, poorly differentiated thyroid cancer cell lines and normal thyroid cell lines; B, moderately differentiated thyroid cancer cell lines and normal thyroid cell lines; C, poorly and moderately differentiated thyroid cell lines.

圖2 人甲狀腺高（H）、中（M）和低（L）分化細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)的關(guān)系Fig. 2 Relationship between differentially expressed proteins in well (H)-, moderately (M)- and poorly (L)-differentiated human thyroid cell lines

3 不同分化程度甲狀腺細(xì)胞間差異蛋白的主要信息通路

使用 Ingenuity Pathway Analysis (IPA)軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白的通路信息分析顯示，正常甲狀腺細(xì)胞系與低分化甲狀腺癌細(xì)胞系間差異蛋白質(zhì)主要參與空泡介導(dǎo)的內(nèi)吞信號(hào)（caveolar-mediated endocytosis signaling）、病毒的內(nèi)吞途徑（virus entry via endocytic pathways）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡（cytotoxic T lymphocyte-mediated apoptosis of target cells）、維生素 C 運(yùn)輸（vitamin C transport）、TR/RXR 激活（TR/RXR activation）、顆粒酶 B 信號(hào)（granzyme B signaling）、樹突細(xì)胞成熟（dendritic cell maturation）、蛋白質(zhì)泛素化通路（protein ubiquitination pathway）等（圖3A）。低分化甲狀腺癌細(xì)胞系與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間差異蛋白質(zhì)主要參與RAN 信號(hào) （RAN signaling）、超氧化物自由基降解（superoxide radicals degradation）、NRF2 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（NRF2-mediated oxidative stress response）、EIF2 信號(hào)通路（EIF2 signaling）、肝纖維化/肝星狀細(xì)胞活化（hepatic fibrosis / hepatic stellate cell activation）、芳香烴受體信號(hào)（aryl hydrocarbon receptor signaling）、上皮細(xì)胞醛固酮信號(hào)（aldosterone signaling in epithelial cells）、TR/RXR 激活（TR/RXR activation）等（圖3B）。

圖3 不同分化程度甲狀腺細(xì)胞間差異蛋白的信號(hào)通路分布。A，正常甲狀腺細(xì)胞系與低分化甲狀腺癌細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)的通路分布；B，甲狀腺低分化與中分化細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)的通路分布Fig. 3 The pathway distribution of the differential proteins between thyroid cells at different levels of differentiation. A, the pathway distribution of differentially expressed proteins between the normal thyroid cell lines and poorly-differentiated thyroid cancer cell lines; B, the pathway distribution of differentially expressed proteins between poorly- and moderately-differentiated thyroid cell lines

4 不同分化程度甲狀腺細(xì)胞間差異蛋白的相互關(guān)系

根據(jù)差異蛋白已有的文獻(xiàn)報(bào)道，利用功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)String網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/cgi/input.pl）對(duì)甲狀腺癌低分化與中分化細(xì)胞系、低分化與正常甲狀腺細(xì)胞系之間差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析。低分化與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間差異表達(dá)的蛋白的相互關(guān)系如圖4A所示，COL1A1與HMGA1之間以及Cav-1與KRT7、HMGA1之間存在相互作用關(guān)系；甲狀腺癌低分化細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白的相互關(guān)系如圖4B所示， COL1A1與HMGA1之間以及Cav-1與KRT7、HMGA1蛋白之間存在相互作用關(guān)系。

圖4 不同分化程度甲狀腺細(xì)胞間差異蛋白間的相互關(guān)系。A，低分化與中分化甲狀腺癌細(xì)胞系間差異表達(dá)的蛋白的相互關(guān)系；B，甲狀腺癌低分化細(xì)胞系與正常甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白的相互關(guān)系；紅色代表上調(diào)的蛋白質(zhì)，綠色代表下調(diào)的蛋白質(zhì)Fig. 4 Interaction between differential proteins of thyroid cells at different levels of differentiation. A, relationship of differentially expressed proteins between poorly and moderately-differentiated thyroid cancer cell lines; B, relationship of differentially expressed proteins between poorly-differentiated thyroid cancer cell lines and normal thyroid cell lines; red representing up-regulated proteins and green representing down-regulated proteins

5 COL1A1、Cav-1、TRX、Rock-1 表達(dá)水平隨細(xì)胞的分化能力而一致性上調(diào)

用免疫印跡分析方法檢測(cè)甲狀腺細(xì)胞系Nthyori3-1和不同分化程度的甲狀腺癌細(xì)胞系THJ-16T、FTC133中COL1A1、COL1A2、Cav-1、FSCN1、TRX、 HMGA1、SOD2、Rock-1、KRT7、KRT8水平 表 明：COL1A1[10]、Cav-1[11]、TRX[12]、Rock1[13]隨細(xì)胞的分化能力的增加有一致的上調(diào)（圖5）。

圖5 Nthy-ori3-1、THJ-16T、FTC133細(xì)胞系中COL1A1、CAV-1、TRX 和ROCK-1表達(dá)的免疫印跡檢測(cè)Fig. 5 Western blot detection for the expression of COL1A1, CAV-1, TRX and ROCK-1 in cell lines Nthy-ori3-1, THJ-16T and FTC133

對(duì)甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori3-1和不同分化程度的甲狀腺癌細(xì)胞系THJ-16T、FTC133中COL1A、TRX和Rock-1表達(dá)水平進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，COL1A、TRX、Rock-1 免疫反應(yīng)性隨細(xì)胞的分化能力而一致性增強(qiáng)（圖6）。

圖6 Nthy-ori3-1、THJ-16T和FTC133細(xì)胞系中COL1A、TRX、Rock-1 表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。A，COL1A、TRX和Rock-1 表達(dá)水平的代表性免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（比例尺，50μm）；B，COL1A、TRX和Rock-1 表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*0.01

討論

通過蛋白組學(xué)[14]方法對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞系和中、低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了全譜系分析，在中分化的甲狀腺癌細(xì)胞系與低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系種檢測(cè)到差異表達(dá)蛋白質(zhì)101個(gè)，獲得正常甲狀腺細(xì)胞與中分化甲狀腺細(xì)胞系差異表達(dá)蛋白質(zhì)103個(gè)，正常甲狀腺細(xì)胞系與低分化甲狀腺癌細(xì)胞系差

異表達(dá)蛋白質(zhì)106個(gè)。結(jié)果證明，基于液質(zhì)聯(lián)用[15]蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯著提高尋找差異蛋白的效率，能高速快捷地檢測(cè)到數(shù)百個(gè)差異蛋白；納升級(jí)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，所需的檢測(cè)樣品更加恒量，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

對(duì)288個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)所在的信息通路進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解到288個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)可能影響的信息通路，便于推測(cè)其生物學(xué)功能。分析表明：差異蛋白質(zhì)主要參與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、維生素C運(yùn)輸、蛋白質(zhì)泛素化、RAN信號(hào) 、超氧化物自由基降解等。根據(jù)目前人類探索蛋白質(zhì)之間相互關(guān)系的文獻(xiàn)，利用String網(wǎng)站勾勒出這些蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，揭示了這些蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)COL1A1與HMGA1之間以及Cav-1與KRT7、HMGA1之間存在相互作用關(guān)系，為后續(xù)蛋白質(zhì)的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和線索。

為了在質(zhì)譜研究和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，不斷地縮小生物標(biāo)記物的范圍，選取COL1A1、COL1A2、Cav-1、FSCN1、TRX、 HMGA1、SOD2、Rock-1 KRT7、KRT8等差異蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析，結(jié)果表明COL1A1、Cav1、TRX、Rock1的表達(dá)隨細(xì)胞的分化能力的增加而上調(diào)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了COL1A、TRX、Rock-1的表達(dá)水平隨細(xì)胞分化能力的增加而上調(diào)。

新的甲狀腺癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，極大地提高了對(duì)甲狀腺癌分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從而為甲狀腺癌患者提供更加個(gè)性化的治療[16]。細(xì)胞系的質(zhì)譜分析為我們的臨床研究提供了基本線索，進(jìn)一步根據(jù)這些基礎(chǔ)研究的線索，進(jìn)行大樣本的臨床驗(yàn)證，篩選出可用于臨床檢測(cè)的生物標(biāo)記物，將提高臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而更好地指導(dǎo)臨床治療。