任湘鵬 ， 侯志東 ， 田 靜， 徐 煌， 王琰萍

（1嘉興學院醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001；2溫州醫(yī)科大學眼視光學院，浙江 溫州 325027；3嘉興學院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 嘉興 314001）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是第二大常見的進行性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是α-突觸核蛋白（α-synuclein，αS）在神經(jīng)元胞體內(nèi)沉積形成路易小體（Lewy bodies），以及黑質多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性丟失。PD 臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩及姿勢平衡障礙等典型運動癥狀，在臨床前驅期還呈現(xiàn)出多樣化的非運動癥狀，如嗅覺、睡眠、便秘、認知及情緒障礙等［1-2］。識別PD 的非運動癥狀是實現(xiàn)早期診斷的重要依據(jù)［3］。目前學術界普遍認為αS 異常聚集和病變傳播是PD 發(fā)病的核心機制［4-5］，也是PD非運動癥狀多樣化的病理基礎［6］。因此，基于αS的動物模型成為研究PD 非運動癥狀的理想動物模型［7］。Giasson 等［8］利用小鼠朊蛋白啟動子過表達人A53T 突變型αS 的方法，制作出A53T αS 轉基因（trangenic，TG）小鼠，并發(fā)現(xiàn)該TG 小鼠最早在8 月齡可出現(xiàn)運動障礙，且腦內(nèi)出現(xiàn)αS 病理性包涵體的廣泛分布。本研究以6 月齡A53T αS TG小鼠為模擬早期PD的動物模型，系統(tǒng)研究其行為學表型及相關病理基礎，以期為闡明PD 的非運動癥狀及病理機制提供實驗基礎。

材料和方法

1 動物

A53T αS TG 小鼠（#004479）購自 Jackson 實驗室。實驗組選用6 月齡A53T αS TG 小鼠，對照組選用同窩生的正常野生型（wild-type，WT）小鼠，每組12只，雌雄不限，體重25～30 g。小鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，自由飲水進食。實驗開展前，小鼠提前1周運至行為學測試專用動物房以適應環(huán)境。動物房室溫22～25 ℃，濕度60%，光暗周期為12 h。所有動物實驗遵循我國《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行。

2 主要試劑

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（ab112）、神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）抗體（ab177487）、Polo 樣激酶 2（Polo-like kinase 2，PLK2）抗 體（ab137539）和 GAPDH 抗 體（ab8245）購自Abcam；Ser129 磷酸化α-突觸核蛋白（phosphorylated α-synuclein，pSyn）抗體（pSyn#64）購自Wako；泛素（ubiquitin，Ub）抗體（sc-8017）和p62抗體（sc-48402）購自Santa Cruz；生物素標記的驢抗鼠Ⅱ抗購自Jackson；山羊抗鼠Alexa Fluor 488、山羊抗兔Alexa Fluor 555 和驢抗鼠Alexa Fluor 594 Ⅱ抗購自Invitrogen；HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠Ⅱ抗購自碧云天公司；ABC 試劑盒和DAB 試劑盒購自Vector；基因組提取試劑盒為Qiagen 產(chǎn)品；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。小鼠基因型鑒定所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據(jù)設計合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 小鼠基因型鑒定 采用Jackson 推薦的標準PCR 方法鑒定 A53T αS TG 及 WT 小鼠的基因型。小鼠剪尾，提取基因組DNA 作為PCR 模板。合成兩對PCR 鑒定的特異性引物，分別用于擴增內(nèi)參照及TG序列。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳、成像，根據(jù)特異性擴增條帶大小判定樣本基因型。

3.2 行為學檢測 對實驗小鼠同時進行一系列行為學測試，測試順序隨機，且對實驗操作者采用盲法。所有行為學測試均在上午08：00～12：00 進行，每組n=12。每只小鼠測試結束后，用70%酒精擦拭行為學實驗裝置并用吸水紙擦干，以減少氣味干擾。

3.2.1 曠場實驗（open-field test）［9］實驗箱為一個尺寸為40 cm×40 cm 的敞箱，上方安裝有攝像機，與EthoVision XT 分析系統(tǒng)相連接，實時追蹤記錄并采集分析小鼠10 min 內(nèi)在實驗箱中總的運動距離，以反映小鼠的自發(fā)運動能力。

3.2.2 懸掛實驗（wire hang test）［10］使用一個鋪有柔軟墊料的大鼠籠和籠蓋，高度定為25 cm 以上；將實驗小鼠置于籠蓋上，輕搖使其抓住籠蓋桿；翻轉并固定籠蓋，同時用秒表計時；當小鼠脫離籠蓋跌落至墊料上時，結束計時，記錄懸掛時間，以反映小鼠的肌力和運動能力。

3.2.3 精細運動測試（fine movement test）［11］在每個鼠籠中左上位置放一個托盤，托盤內(nèi)放入30 顆原味生瓜子；隨著時間的變化，小鼠嗑瓜子數(shù)目逐漸提高，表明小鼠在該行為學測試中訓練成功；分別記錄1、3、8和24 h時小鼠磕的總瓜子數(shù)，以反映小鼠的精細運動能力。

3.2.4 Y 迷宮自發(fā)交替行為（spontaneous alternation behavior，SAB）實驗［9］標記 Y 迷宮 3 個臂分別為 A、B 和C，將小鼠置于A 臂末端，讓小鼠在 Y 迷宮內(nèi)自由探索5 min；記錄小鼠依次進臂的順序，統(tǒng)計正確的輪替次數(shù)（依次進入3 個不同的臂）和總輪替次數(shù)（總進臂次數(shù)-2），兩者比值為SAB 正確率（%），以此評價小鼠的工作記憶。

3.2.5 高架十字迷宮（elevated plus maze）［10］將小鼠置于高架十字迷宮的中心區(qū)域，即4個臂交接之處，頭朝著開放臂，錄像設備實時記錄并采集小鼠5 min內(nèi)在開放臂與封閉臂的活動時間，以小鼠在開放臂停留的時間反映小鼠的焦慮狀態(tài)。

3.2.6 懸尾實驗（tail suspension test）［12］將小鼠尾部后1/3處用膠帶固定在金屬籠蓋上，懸掛在地板上方，頭部距離臺面15 cm，實時采集小鼠5 min內(nèi)的肢體運動情況，記錄肢體不動的時間，以反映小鼠的抑郁樣行為。

3.2.7 三箱社交實驗（three-chambered social approach task）［13］實驗操作箱為40 cm×20 cm的3個小室組成，小室之間有隔板，僅留7 cm寬的通道。箱子上方安裝有與行為學記錄分析系統(tǒng)相連接的攝像機，記錄小鼠在箱子中的運動軌跡。適應期（第一時相）：在操作箱的左上和右下各放置一個空塑料罩，將測試鼠輕輕放入中間小室，自由探索10 min。測試期：（1）第二時相：選一只目標鼠隨機放進其中一個塑料罩內(nèi)，讓測試鼠自由探索10 min，統(tǒng)計測試鼠分別在3個小室內(nèi)停留的時間，以測試鼠和目標鼠的交流時間反映其社交能力；（2）第三時相：另選一只目標鼠放進另一個塑料罩內(nèi)，讓測試鼠再次自由探索10 min，統(tǒng)計測試鼠分別在左、右小室停留的時間（測試鼠與新舊兩只目標鼠的交流時間）反映其社交記憶能力。

3.3 組織病理學檢測 行為學測試結束，小鼠經(jīng)麻醉、灌注、斷頭取腦、4%多聚甲醛溶液固定及脫水等一系列預處理后進行皮層、紋狀體和黑質區(qū)冠狀位冰凍切片，每組n=6，切片厚度30 μm，存放于4 ℃冰箱的冰凍保存液中備用。

3.3.1 免疫組織化學染色［9］采用免疫組化染色法檢測兩組小鼠腦內(nèi)黑質區(qū)TH 陽性細胞數(shù)及皮層區(qū)αS 包涵體。腦片室溫復溫、漂洗后，免疫染色抗體稀釋液1∶1 000 稀釋Ⅰ抗（TH 和pSyn 抗體），室溫慢搖孵育過夜。用免疫染色抗體稀釋液1∶1 000 稀釋生物素標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。用ABC 復合物室溫孵育1 h，以DAB 溶液顯色10 min。蘇木素復染細胞核45 s 后，室溫下晾干、梯度脫水、中性樹膠封片晾干后在顯微鏡下拍攝。

3.3.2 免疫熒光共染［9］將 A53T αS TG 小鼠皮層腦片進行pSyn 與Ub（αS 包涵體的另一主要成分）、p62（蛋白質聚集的標志物）及NeuN（神經(jīng)元特異性標志物）的免疫熒光共染。腦片室溫復溫、漂洗后，用免疫染色抗體稀釋液稀釋Ⅰ抗（pSyn，1∶1 000；Ub 和p62，1∶50；NeuN，1∶500），室溫孵育過夜。用免疫染色抗體稀釋液1∶1000 稀釋Ⅱ抗，室溫避光孵育2 h。腦片漂洗，用含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片后，共聚焦顯微鏡z軸掃描拍攝。

3.4 Western blot［14］PLK2 能特異性磷酸化 αS 的Ser129 位點［15］，對αS 病變傳播具有重要意義。為探究A53T αS TG 小鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)的αS 病理性包涵體是否與PLK2 相關，本研究采用Western blot 法定量檢測兩組小鼠腦內(nèi)皮層區(qū)PLK2的表達水平，同時定量檢測兩組小鼠腦內(nèi)黑質區(qū)TH 的表達水平。小鼠迅速斷頭取腦，分離出皮層、紋狀體和黑質區(qū)腦組織，每組n=6。加入強RIPA 細胞裂解液和蛋白酶抑制劑進行裂解，4 ℃、9 800×g離心 10 min 后取上清液，并采用BCA 法進行蛋白定量。用12% SDSPAGE 分離蛋白并轉印至 PVDF 膜后，5% BSA 室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗（TH，1∶1 000；PLK2，1∶3 000；GAPDH，1∶5 000）4 ℃孵育過夜（至少16 h）。次日，反復洗膜3 次后，HRP 的標記Ⅱ抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯影，掃描。用圖像處理系統(tǒng)對條帶灰度進行分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)作圖采用GraphPad Prism 6 軟件完成。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）表示。方差齊性檢驗采用Levene法，兩組樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 A53T αS TG小鼠基因型鑒定PCR結果

“+”顯示的樣本PCR 擴增條帶大小約為250 bp，和A53T αS TG 特異性引物的擴增條帶預期大小相符，均為 A53T αS TG 小鼠；其余樣本的 PCR 擴增條帶大小超過300 bp，均為WT小鼠，見圖1。

Figure 1. PCR results for genotype identification of A53T αS TG mice. M：DNA marker；1 to 16：sample number；CON：negative control；+：A53T αS TG positive sample.圖1 A53T αS TG小鼠基因型鑒定PCR結果

2 6 月齡A53T αS TG 小鼠未出現(xiàn)運動、工作記憶及情緒樣行為障礙

曠場實驗結果顯示，與WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠在曠場實驗箱中10 min 內(nèi)總的運動距離無顯著差異（P＞0.05），見圖2A。懸掛實驗結果顯示，與WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠的懸掛時間無顯著差異（P＞0.05），見圖2B。精細運動測試結果顯示，隨著時間的變化（1、3、8 和24 h），兩組小鼠的嗑瓜子數(shù)目均逐漸提高，而在每個時點兩組間差異均無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖2C。SAB 檢測結果顯示，A53T αS TG小鼠在Y迷宮中5 min內(nèi)的SAB正確率與WT小鼠相比無顯著差異（P＞0.05），見圖2D。高架十字迷宮檢測結果顯示，A53T αS TG 小鼠5 min內(nèi)在開放臂停留的時間與WT 小鼠相比無顯著差異（P＞0.05），見圖2E。懸尾實驗結果顯示，與WT小鼠相比，A53T αS TG小鼠5 min內(nèi)肢體靜止不動的時間無顯著差異（P＞0.05），見圖2F。

Figure 2. Six-month-old A53T αS TG mice did not develop motor，working memory and emotion-like behavior disorders. A：openfield test；B：wire hang test；C：fine movement test；D：spontaneous alternation behavior（SAB）test；E：elevated plus maze test；F：tail suspension test. Mean±SEM. n=12.圖2 6月齡A53T αS TG小鼠未出現(xiàn)運動、工作記憶及情緒樣行為障礙

3 6月齡A53T αS TG小鼠出現(xiàn)社交認知障礙

三箱社交行為學測試（圖3A）結果顯示，在經(jīng)過操作箱適應期（第一時相）后，兩組小鼠在測試期第二時相停留在目標鼠小室的時間較空塑料罩小室相比均顯著增加（P＜0.05）；但與WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠停留在目標鼠小室的時間并無顯著差異（P＞0.05），見圖3B。在測試期第三時相，WT 小鼠與新目標鼠的交流時間［（238.59±21.50）s］較舊目標鼠［（194.76±26.21）s］顯著增加（P＜0.05）；反之，A53T αS TG 小鼠與新目標鼠的交流時間［（161.05±17.33）s］較舊目標鼠［（251.65±21.67）s］顯著縮短（P＜0.01）；與WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠與新目標鼠的交流時間同樣顯著縮短（P＜0.01），見圖3C。

4 6 月齡 A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)黑質區(qū) TH 的表達水平未出現(xiàn)改變

免疫組化染色結果顯示，與WT 小鼠相比，A53T αS TG小鼠腦內(nèi)黑質區(qū)未出現(xiàn)TH陽性神經(jīng)元的變性丟失，見圖4A。Western blot 檢測結果顯示，A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)黑質區(qū)TH 的表達水平未出現(xiàn)顯著改變（P＞0.05），見圖4B。

Figure 3. Six-month-old A53T αS TG mice developed social cognition impairment. A：social cognitive ability tested by three-chambered social approach task；B：A53T αS TG mice showed normal social activity in phase 2；C：A53T αS TG mice showed social cognition impairment in phase 3. Mean±SEM. n=12.*P＜0.05 vs empty object；#P＜0.05，##P＜0.01 vs old mouse；△△P＜0.01 vs WT.圖3 6月齡A53T αS TG小鼠出現(xiàn)社交認知障礙

Figure 4. The expression level of TH did not change in the substantia nigra of 6-month-old A53T αS TG mice. A：representative immunohistochemical staining images for TH in the substantia nigra，A53T αS TG mice did not show degeneration and loss of TH-positive neurons in the substantia nigra region of the brain compared with WT mice（scale bar=0.1 mm）；B：representative Western blot images and statistical results of TH expression in the substantia nigra. Mean±SEM. n=6.圖4 6月齡A53T αS TG小鼠腦內(nèi)黑質區(qū)TH的表達水平未出現(xiàn)改變

5 6 月齡 A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)皮層區(qū)出現(xiàn) αS 病理性包涵體

免疫組化染色結果顯示，A53T αS TG 小鼠皮層腦區(qū)出現(xiàn)pSyn 包涵體，紋狀體及黑質腦區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)病理性包涵體；pSyn 包涵體陽性的皮層細胞百分比為（20.68±4.41）% ，顯 著 高 于 對 照 組［（3.05±0.87）%；P＜0.01］，見圖5A。免疫熒光共染及共聚焦顯微鏡z軸掃描顯示，pSyn與Ub、p62及NeuN均有良好的共定位表達，見圖5B。

6 6 月齡 A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)皮層區(qū) PLK2 的表達水平上調(diào)

Western blot 檢測結果顯示，與WT 小鼠相比，A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)皮層PLK2 的表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖6。

討 論

Figure 5. The αS pathological inclusions were detected in the brain cortical region of 6-month-old A53T αS TG mice（scale bar=0.01 mm）. A：representative immunohistochemical staining images for pSyn in the cortex and statistical results of pSynpositive cells（arrows point to pSyn-positive αS pathological inclusions）；B：representative immunofluorescence staining images for pSyn（green）co-localized with Ub（red），p62（red）and NeuN（red）were shown，while cell nuclei were stained with DAPI（blue）. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs WT.圖5 6月齡A53T αS TG小鼠腦內(nèi)皮層區(qū)出現(xiàn)αS病理性包涵體

模擬αS 聚集和傳播的αS TG 小鼠是研究PD 非運動癥狀的理想動物模型，利用不同的TG 過表達策略，研究人員已開發(fā)出多種不同的αS TG PD 小鼠模型［7］。本研究以 6 月齡 A53T αS TG 小鼠為模擬早期PD 的動物模型，系統(tǒng)研究其行為學表型及相關病理改變，結果表明6 月齡A53T αS TG 小鼠在運動功能改變之前出現(xiàn)社交記憶障礙，可能與皮層中αS 病理性包涵體相關。

本研究結果表明，6 月齡 A53T αS TG 小鼠尚未出現(xiàn)運動功能障礙及DA 能神經(jīng)元的選擇性變性丟失，但可檢測到αS病理性包涵體的存在，證實了6月齡A53T αS TG 小鼠可作為模擬PD 發(fā)病早期的動物模型。這與Giasson 等［8］的研究結果一致，其研究顯示A53T αS TG 小鼠最早從8個月開始出現(xiàn)進行性運動障礙，平均發(fā)病周期在 14～15 月，8～12 月齡 TG 小鼠腦內(nèi)廣泛分布著αS 包涵體。本研究結合曠場實驗、懸掛實驗及精細運動測試觀察兩組小鼠的自主運動、肌張力及精細運動能力，結果均表明6 月齡A53T αS TG 小鼠尚未出現(xiàn)運動能力受損。考慮到PD 模型小鼠運動能力改變和非運動行為學表型密切相關，我們可排除后續(xù)對PD 模型小鼠非運動功能檢測時可能受到的影響。

Figure 6. The expression level of PLK2 was up-regulated in the brain cortical region of 6-month-old A53T αS TG mice. Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs WT.圖6 6月齡A53T αS TG小鼠腦內(nèi)皮層區(qū)PLK2的表達水平上調(diào)

情緒障礙是PD 早期的非運動癥狀之一，主要表現(xiàn)為焦慮、抑郁等［1］。情緒樣行為障礙已在不同的αS TG PD 模型小鼠中得到了驗證［16-17］，如 Graham等［16］發(fā)現(xiàn)，8～12 月齡A53T αS TG 小鼠表現(xiàn)出多動和焦慮樣行為的減少。本實驗利用高架十字迷宮和懸尾實驗檢測早期PD 模型小鼠的情緒樣行為，結果表明6 月齡A53T αS TG 小鼠未出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒樣行為，提示不同月齡的αS TG 小鼠可表現(xiàn)出不同的情緒樣行為。

認知障礙是PD 最重要的非運動癥狀之一，可出現(xiàn)在PD 病程的各個時期［18］，工作記憶是評價認知功能的重要指標。已有多項研究對不同PD TG 小鼠模型的認知功能進行了系統(tǒng)測試［19-21］：Paumier 等［20］的研究表明，6 和 12 月齡 A53T αS TG 小鼠在 Y 迷宮檢測中表現(xiàn)出空間記憶損害；Freichel 等［21］利用水迷宮檢測了A30P 突變型αS TG 小鼠的工作記憶能力，結果表明，4 月齡TG 小鼠的工作記憶正常，而12 月齡TG小鼠則出現(xiàn)明顯的工作記憶障礙。本研究利用Y迷宮自發(fā)交替行為學檢測早期PD 模型小鼠的工作記憶，結果表明6 月齡A53T αS TG 小鼠尚未出現(xiàn)工作記憶損害。不同品系、不同月齡的αS TG 小鼠，以及不同的工作記憶行為學研究范式，都會對實驗結果產(chǎn)生影響?？紤]到工作記憶障礙呈現(xiàn)明顯的年齡依賴性［21］，后續(xù)研究有必要使用不同月齡的αS TG小鼠來模擬PD 發(fā)病的各個時期，系統(tǒng)比較其工作記憶損害的時間特性。

社交認知障礙是一種常見的認知障礙，可出現(xiàn)在PD病程的各個階段［22-23］。本研究利用三箱社交試驗檢測了早期PD 模型小鼠的社交及社交記憶能力，結果表明6 月齡A53T αS TG 小鼠的社交能力正常，但出現(xiàn)社交記憶損害。與本項工作的研究結果一致，Magen 等［24］利用三箱社交行為學方法研究了Thy1-aSyn（Thy1 啟動子驅動人野生型αS基因過表達）TG PD 小鼠模型的社交認知行為，結果表明，Thy1-aSyn 小鼠表現(xiàn)出進行性的社交認知功能損害；3～4 月齡Thy1-aSyn 小鼠尚未表現(xiàn)出社交認知障礙，而7～8 月齡Thy1-aSyn 小鼠則表現(xiàn)出顯著的社交認知功能下降。Stanojlovic 等［25］同樣在 A53T αS TG 小鼠模型中觀察到年齡依賴性的進行性社交記憶損害。今后可進一步使用不同月齡的A53T αS TG 小鼠，研究其社交認知障礙在不同時間點呈現(xiàn)的進行性特點。

目前，PD 認知障礙的神經(jīng)機制尚不清楚，可能與皮層中αS 免疫陽性路易小體相關［26］。本研究通過免疫組化和免疫熒光共染實驗發(fā)現(xiàn)，6 月齡A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)皮層神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)αS 病理性包涵體，提示可能與其社交認知障礙相關。進一步研究表明，6 月齡 A53T αS TG 小鼠腦內(nèi)皮層區(qū) PLK2 的表達水平上調(diào)，提示PLK2 活性提高，促進皮層中αS 的磷酸化和異常聚集，導致皮層神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)αS 病理性包涵體。A53T αS TG小鼠社交認知障礙的神經(jīng)機制尚需深入研究。

綜上所述，本研究表明A53T αS TG PD 模型小鼠早期出現(xiàn)社交認知障礙，進一步驗證了該模型可作為研究PD 非運動癥狀的動物模型，提示社交認知損害可能是早期PD 認知障礙的臨床預測指標，有望發(fā)展成PD早期診斷的標志物。