劉侃玲， 張 瑤

（1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院心血管臨床醫(yī)學中心，湖北 武漢 430077；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院內分泌科，湖北 武漢 430077）

過度磷酸化并錯誤折疊的人類τ 蛋白（human tau protein，hTau）參與20多種神經退行性疾病，如阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，FTD）等，被統(tǒng)稱為τ 蛋白?。╰auopathies）［1-2］。依據hTau 累積程度描述疾病進程的Braak 分期方法是一種國際認可的神經退行性疾病的病理診斷方法［3］。此外，腦脊液中的hTau 含量也與記憶能力呈負相關［4］。

神經炎癥是神經退行性疾病早期的一個重要病理特征［5］。促炎因子如白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）主要由包括小膠質細胞和星型膠質細胞在內的免疫細胞分泌［6］。正常情況下膠質細胞主要起支持與營養(yǎng)神經元作用，并具備吞噬異物和清除有害物質的功能［7］。除膠質細胞外，神經元也可分泌促炎因子，引起膠質細胞激活從而分泌更多促炎因子。在6 月齡轉基因hTau小鼠中觀察到膠質細胞增多和促炎因子水平上升等神經炎癥相關指標，但未出現明顯hTau 聚集與行為學改變等病理癥狀［8］，提示早期神經炎癥參與hTau 引起的神經退變，但相關分子機制尚未闡明。

材料和方法

1 實驗動物及材料

2 月齡 SPF 級 C57 小鼠 10 只，體重（25±2）g，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院醫(yī)學動物實驗中心，許可證號為SYXK（鄂）2021-0057。小鼠神經母膠質瘤N2a 細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。包含hTau基因和T 細胞內抗原1（T-cell intracellular antigen 1，TIA1）基因的質粒由北京奧科鼎盛合成并構建于pEGFP-N1 質粒載體上?？?GFP、TIA1 和 GAPDH 抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司；抗絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP1）抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；抗細胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK抗體購于Cell Signaling Technology；抗HT7 抗體（特異性識別過表達的hTau 蛋白）購于Thermo Fisher；攜帶hTau的腺相關病毒（hTau-carrying adeno-associated virus，hTau-AAV）購于上海禾元生物；免疫組化顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與處理 N2a細胞培養(yǎng)于T25 細胞培養(yǎng)瓶，每2～3 d 更換新鮮培養(yǎng)基（DMEM+10%胎牛血清+1%青/鏈霉素）。對于TIA1 或hTau 過表達，N2a細胞提前種植于6 孔板，并于細胞密度達到70%～80%時進行轉染，分成空載體（vector，VEC）組（轉染pPEGFP-N1 質粒）、hTau 過表達組（轉染pEGFP-hTau質粒）和TIA1 過表達組（轉染pECFP-TIA1 質粒）。轉染步驟如下：用50 μL無血清培養(yǎng)基分別稀釋空載體與 TIAI 質粒 2 μg 并輕輕混勻；在另外 50 μL 無血清培養(yǎng)基加入2 μL質粒轉染試劑。室溫孵育5 min，將前兩步所稀釋的質粒與質粒轉染試劑混合并混勻，室溫放置20 min，每孔細胞中加入100 μL混合后的轉染液，輕輕搖勻。N2a細胞在轉染48 h后檢測相關因子的mRNA 和蛋白表達。對于siRNA 轉染，將細胞分成VEC+正常對照（normal contol，NC）組（轉染空載體pEGFP-N1和siRNA 對照）、VEC+si-TIA1組（轉染空載體pEGFP-N1 和TIA1siRNA）、hTau+NC 組（轉染pEGFP-hTau 質粒和siRNA 對照）和hTau+si-TIA1 組（轉染pEGFP-hTau 質粒和TIA1siRNA）。轉染步驟參考上述描述。

2.2 Western blot N2a 細胞進行質粒轉染48 h 后收集，加入含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液后，置于冰上裂解15 min，4 ℃低溫離心機中以13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度，然后煮沸10 min 變性。每組加入等量蛋白樣品進行電泳和轉膜。采用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，分別加入對應Ⅰ抗抗體和內參照抗體孵育過夜；TBST 清洗5 min×3 次。加入山羊抗兔或鼠Ⅱ抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST 清洗5 min×3 次，采用ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)（ChemiScope 6000 Pro）掃描拍照。采用ImageJ軟件測量灰度并進行統(tǒng)計分析。

2.3 免疫組織化學 C57 小鼠小鼠隨機分為VEC組和hTau過表達組（hTau組），每組5只，VEC組小鼠海馬 CA1 區(qū)注射 AAV-vector 空載病毒，hTau 組小鼠海馬CA1區(qū)注射注射AAV-hTau，1×1012滴度1 μL，其中CA1 區(qū)定位坐標為：AP 1.8 mm，ML ±1.2 mm，DV 1.2 mm。4 周后采用4%多聚甲醛灌流固定并用冰凍切片機切片，厚度30 μm。小鼠腦切片用PBS漂洗5 min×3 次，1% TritonX-100 破膜 15 min；再用 0.3%雙氧水去除內源性過氧化物酶30 min；最后用5%BSA 室溫封閉 30 min，加入抗 HT7 或 MKP1 抗體（1∶100）孵育過夜；次日回收抗體后 PBS 洗 5 min×3 次，生物素標記Ⅱ抗IgG，37 ℃孵育30 min。PBS 沖洗，5 min×3 次。滴加底物試劑 SABC，37 ℃孵育30 min。PBS 沖洗，5 min×3 次。鏡下控制反應時間滴加顯色劑DAB。顯色結束后使用自來水充分沖洗，最后脫水透明并封片。用Nikon 顯微鏡（SV120）拍照并使用ImageJ軟件分析。

2.4 PCR 擴增 N2a 細胞轉染質粒 48 h 后，使用Trizo（lInvitrigen）試劑盒提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測樣品A260 和A280，計算RNA 濃度和純度，各取1 μg，利用逆轉錄試劑盒（Yeasen）生成互補DNA 鏈（cDNA）。各取1 μL cDNA 作為模板，應用進行實施 PCR 擴增（Heal Force T960）。MKP1 上游引物序列為 5′-CCGCCTTGATCAACGTCTCA-3′，下游引物序列為 5′-GGAGCTGATGTCTGCCTTGT-3′；內參ACTB 上游引物序列為5'-CCCCTGAACCCTAAGGCCA-3'，下游引物序列為5'-CGGAGTCCATCACAATGCCT-3′。反應程序為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 60 s，循環(huán) 35 次。PCR 產物采用瓊脂糖凝膠分離，條帶采用ImageJ軟件進行灰度分析。

2.5 免疫熒光染色 細胞爬片采用多聚賴氨酸包被后種植N2a 細胞，然后進行質粒轉染與培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后細胞爬片采用4%多聚甲醛室溫固定30 min；1%Triton X-100破膜5 min；0.3%雙氧水去除內源性過氧化物酶30 min；最后用5% BSA 室溫封閉30 min，加入抗MKP1 抗體（1∶100）孵育過夜；次日回收抗體后 PBS 洗 5 min×3 次。加入 FITC 標記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶150），避光室溫孵育1 h；PBS洗5 min×3次，滴加核染料DAPI 避光室溫孵育10 min，PBS 洗5 min×3 次，封片。每張片子隨機選取5 個視野進行拍照，熒光顯微鏡下觀察，采用ImageJ軟件進行分析。

2.6 RNA 免疫沉淀 N2a 細胞轉染 hTau 質粒 48 h后，將細胞培養(yǎng)基去除并用PBS漂洗3次。將細胞培養(yǎng)板置于紫外燈10 cm 下照射15 min，以固定RNA/蛋白復合物。加入裂解液［24 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol/L KCl，2 mmol/L EDTA，0.5%NP40，1 mmol/L NaF，1 mmol/L DTT，100 U/mL RNasin］裂解細胞，冰上裂解10 min，將細胞刮下，4 ℃、14 000 r/min 離心 10 min，取出上清，加入 Protein A/G 樹脂和抗TIA1 抗體，4 ℃旋轉過夜。次日將復合物于4 ℃、8 000 r/min 離心 10 min 后，棄上清，再采用 Trizol 方法提取RNA。最后加入30 μL DEPC 水溶解后，用MKP1引物進行PCR擴增，PCR產物采用瓊脂糖凝膠分離，條帶采用ImageJ軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用SPSS 22.0 軟件進行分析。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間均數比較采用Student-t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 過表達hTau 激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路并促進炎癥因子產生

為研究hTau 與炎癥因子相關通路的關系，我們首先將包含hTau基因的質粒轉染入N2a 細胞，48 h后將細胞收集并裂解。采用Western blot 驗證與炎癥通路相關的MAPK 通路，這條信號通路包括ERK1/2、P38 與 JNK 等因子。如圖 1A 所示，與空載體對照組相比，過表達hTau 顯著激活ERK1/2、P38和JNK 的磷酸化。此外，細胞內的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α 表達水平顯著上升（圖1B）。以上結果提示，過表達hTau可能通過激活MAPK通路，促進炎癥因子的產生。

2 過表達hTau下調MKP1蛋白水平

MAPK 通路的活性受上游MKP1 的調控。采用免疫組織化學染色發(fā)現，與空載體對照組相比，C57小鼠過表達hTau 蛋白4 周后（圖2A），海馬CA1（cornu ammonis 1）區(qū)和齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)MKP1 表達顯著減少（圖 2B）。N2a 細胞轉染hTau 質粒后，MKP1 的免疫熒光強度比空載體對照組弱（圖2C）。Western blot 也驗證過表達 hTau 降低 N2a 細胞MKP1 的蛋白水平（圖2D）。以上結果提示，在細胞和動物水平上過表達hTau 均可下調MKP1 的蛋白水平。

3 敲減TIA1 抑制hTau 誘導的MKP1 蛋白水平降低

TIA1 作為一個 RNA 結合蛋白，在 mRNA 水平調控多種蛋白因子的表達。研究表明，TIA1 受到hTau調控并影響其 RNA 結合與調控能力［9］，但 TIA1 是否參與hTau 抑制MKP1 的過程尚未見報道。在N2a 細胞過表達hTau 質粒轉染48 h 后發(fā)現，hTau 在誘導MKP1 下調時，上調TIA1 的蛋白水平（圖3A）。為驗證TIA1 是否介導hTau 對MKP1 的下調作用，我們在過表達hTau 的同時采用siRNA 下調TIA1，觀察到敲減TIA1可恢復由hTau 誘導的MKP1 下降，同時抑制MAPK通路的激活（圖3B）。

Figure 1. Overexpression of hTau activated MAPK pathway and increased proinflammatory factors. A：after transfection with hTau plasmid，N2a cells were collected and analyzed by Western blot using GFP（tagging hTau plasmid），p-P38，p-JNK and p-ERK1/2 antibodies，and the protein levels of p-P38，p-JNK and p-ERK1/2 in N2a cells were shown；B：the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in N2a cells 48 h after transfection with hTau plasmid. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector（VEC）group.圖1 過表達hTau激活MAPK通路并上調促炎因子水平

4 過表達TIA1下調MKP1蛋白水平

為進一步確認TIA1 為MKP1 的上游調控因子，我們在N2a 細胞內分別過表達hTau 和TIA1，觀察到過表達TIA1 在下調MKP1 的同時激活MAPK 通路，上調相關炎癥因子的表達，與過表達hTau 蛋白效果相似（圖4A）。以上結果進一步確證了MKP1蛋白表達水平受到TIA1的調控。

5 TIA1 結合 MKP1 mRNA 并降低 MKP1 mRNA水平

TIA1 作為RNA 結合蛋白，其主要功能是結合RNA 序列調控基因的表達。通過PCR 檢測發(fā)現，與空載體對照組相比，MKP1的mRNA 表達水平在過表達hTau和TIA1組均顯著下降（圖5A）。采用RNA 免疫沉淀方法，在過表達hTau 的N2a 細胞用TIA1 抗體將與之結合的RNA 沉淀，使用MKP1 特異性引物進行擴增發(fā)現，MKP1 mRNA 與TIA1 結合在過表達hTau 組明顯上升（圖5B）。這提示TIA1 可能與MKP1 mRNA結合并抑制其轉錄乃至翻譯。

討 論

hTau與神經退行性疾病的關聯一直被不斷的臨床數據與動物實驗證實，但其基本作用機制尚未被完全闡明。本研究發(fā)現，過表達hTau 通過上調TIA1降低MKP1的mRNA 和蛋白水平，激活MAPK 通路并促進炎癥因子產生和釋放。這為研究τ 蛋白病提供了一個潛在的治療靶點。

Figure 2. Overexpression of hTau decreased the protein level of MKP1 in mouse hippocampus. A：AAV-hTau was injected into hippocampal CA1 region of C57 mice，and the hippocampus was examined by immunohistochemistry using HT7 antibody（specific recognition epitope of hTau）4 weeks later；B：representative images of MKP1 stained in the hippocampus of C57 mice 4 weeks after injection of AAV-hTau，and relative expression of MKP1 in CA1 and DG regions；C：representative images of MKP1 stained in N2a cells 48 h after transfection with hTau plasmid，and the fluorescence intensity of MKP1；D：the protein level of MKP1 in N2a cells 48 h after transfection with hTau plasmid was detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vector（VEC）group.圖2 過表達hTau降低小鼠海馬MKP1蛋白水平

神經炎癥主要表現是小膠質細胞過度激活從而釋放促炎因子［10］。雖然hTau 主要聚集在神經元，但可通過傳播并激活小膠質細胞［11］，表明神經元是激活小膠質細胞的關鍵因素。有研究者提出關于炎癥與AD 病理的假說表明，炎癥應激的神經元內過度磷酸化的hTau 與聚集hTau 在樹突的錯誤定位可導致β-淀粉樣蛋白前體（amyloid β-protein precursor，APP）生成增加［12-13］。在生理條件下，產生的APP聚集物被小膠質細胞清除。但在病理性衰老的背景下，隨著促炎細胞因子釋放增加，小膠質細胞吞噬功能失調并過度激活，這將導致暴露于促炎環(huán)境中的神經元沒有小膠質細胞的保護而受到損傷。軸突細胞骨架的破壞和軸突運輸的障礙，以及損傷神經突無法被過度反應小膠質細胞清除都表明神經元損傷［14］。在這過程中，促炎因子起著重要的介導作用［15］。因此，抑制促炎因子的產生與釋放可有效減緩疾病的進程。MAPK 通路通過激活NF-κB 直接參與促炎因子的轉錄和翻譯，抑制MAPK 通路也可在一定程度上改善與神經炎癥相關的疾病模型［16］。本研究發(fā)現，細胞過表達hTau 可激活MAPK 通路，但未觀察到APP 蛋白的表達增加（數據未展示），可能是體外細胞實驗表達hTau時間短未觀察到相關變化所致。

Figure 3. Knockdown of TIA1 inhibited hTau-induced decrease in MKP1 and activation of MAPK pathway. A：overexpression of hTau in N2a cells for 48 h induced decreased MKP1 along with increased TIA1；B：knockdown of TIA1 by siRNA in N2a cells transfected with hTau plasmid increased protein level of MKP1 and inhibited MAPK pathway. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vector（VEC）group；#P＜0.05 vs VEC+normal control（NC）group；&P＜0.05 vs hTau+NC group.圖3 敲減TIA1抑制hTau誘導的MKP1下降及MAPK通路激活

Figure 4. Overexpression of TIA1 induced decrease in MKP1 and activation of MAPK pathway in N2a cells. A：Western blot analysis of MKP1，p-P38，p-JNK and p-ERK1/2 in N2a cells 48 h after transfection with TIA1 or hTau plasmid；B：the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in N2a cells 48 h after transfection with TIA1 or hTau plasmid. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vector（VEC）group.圖4 過表達TIA1降低MKP1蛋白水平并激活MAPK通路

Figure 5. TIA1 bound to MKP1 mRNA and inhibited its expression. A：representative image of MKP1 mRNA expression after overexpression of TIA1 or hTau in N2a cells，and relative mRNA level of MKP1 in N2a cells；B：representative image of MKP1 mRNA after RNA immunoprecipitation in N2a cells transfected with hTau，and relative mRNA level of MKP1 in N2a cells. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vector（VEC）group.圖5 過表達TIA1通過結合MKP1 mRNA抑制其轉錄

一項研究表明，MKP1在亨廷頓病患者腦組織中的表達下調［17］；在APP轉基因小鼠中也發(fā)現MKP1的表達呈下降趨勢［18］，表明MKP1 與神經退行性疾病有關聯。MKP1 屬于 MAPK 家族，是 P38、JNK 和ERK1/2 的主要負調控因子。MKP1 參與氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡，通過調節(jié)MAPK 信號通路來調節(jié)各種疾病，在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用。由于MAPK 通路在炎癥的起始階段必不可少，MKP1 被認為是炎癥消退中的關鍵［19］。MKP1全敲除小鼠對內毒素血癥、敗血癥和其他炎癥性疾病模型非常敏感［20］。因此，調控MKP1 表達對于抗炎作用顯得尤為重要。在本次實驗中發(fā)現，過表達hTau 可抑制MKP1 表達，而這依賴于TIA1 作為RNA結合蛋白調控MKP1 mRNA 的翻譯。降低TIA1 表達可顯著減輕轉基因hTau（P301S）小鼠模型的神經變性［9］。在外周組織細胞受到外界應激時，TIA1 起抗炎作用，是因為它可結合到細胞質應激顆粒中的促炎和促凋亡介質的mRNA 上并抑制其翻譯［21］。但在中樞組織里，TIA1 的作用完全不一樣。降低TIA1 含量起神經保護作用證明了其在傳播τ 蛋白低聚物介導的神經退行性變中是必要的，TIA1 介導內源性和外源性τ 蛋白的神經退行性變。在本研究中也得到相似的實驗結果。過表達TIA1抑制MKP1表達并激活MAPK 通路，RNA 免疫沉淀實驗證明其與MKP1 mRNA 的結合增加，但MKP1 mRNA 的翻譯減少，表明TIA1對MKP1起翻譯抑制作用。

本研究發(fā)現，過表達hTau 通過TIA1 負向調控MKP1，進而激活MAPK 信號通路，促進下游炎癥因子的產生與釋放，最終導致神經炎癥的發(fā)生。但本次實驗主要在體外細胞模型進行，缺乏動物實驗證據，下一步的探索將集中在動物水平進行。