黃銘理，王於塵，嚴(yán)紫嫣，方翊靈，劉燕娜，耿艦，鄧文鋒，肖露露，徐健，苗蕓 （.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院器官移植科，廣東 廣州 5055；.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 009；.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州5055）

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展，人口流動(dòng)性不斷增強(qiáng)，此外，我國器官移植體系逐步規(guī)范，部分醫(yī)院不再具有器官移植資質(zhì)，造成相當(dāng)數(shù)量的受者在非手術(shù)醫(yī)院進(jìn)行長期隨訪的現(xiàn)狀?？绲貐^(qū)、跨醫(yī)療中心的移植后隨訪常造成供者人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）分型信息的佚失，對(duì)群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）陽性受者體內(nèi)供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）的判讀造成了不小的困難。本研究通過2 個(gè)案例和相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，為供者HLA 分型信息缺失并可疑抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)（antibodymediated rejection，AMR）的臨床情景提供DSA 判讀的方法，以提高臨床診療的準(zhǔn)確性。

1 方 法

1.1 組織消化與DNA 提?。盒⌒募粝? mm3待測(cè)新鮮移植腎組織，加入800 μl 裂解液以及40 μl 蛋白酶K，56℃水浴48 ～ 72 h，直至組織全部溶解。在組織溶解液中加入異丙醇，混勻并離心后取沉淀。使用70%乙醇洗滌2 ～ 3 次，150 μl 洗脫液溶解干燥后的DNA 沉淀。或根據(jù)NuClean FFPE DNA Kit（康為世紀(jì)，CW2646S）試劑盒說明在石蠟切片中提取DNA。將提取完成的DNA 使用濃度測(cè)定儀進(jìn)行濃度測(cè)定，選取濃度在30 ng/μl 以上，純度（OD260/OD280）為1.7 ～1.9 的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2 HLA 分型：使用NGSgo-AmpX 試劑盒（GenDx）進(jìn)行HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1 位點(diǎn)基因擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增子序列匯集后酶切修飾（NGSgo LibrX 試劑盒，GenDx 公司），之后依照NGSgo 說明書將每個(gè)樣本添加“barcode”信息（NGSgo-Indx 試劑盒，GenDx 公司）。最后將所有樣本匯集上機(jī)進(jìn)行illumina MiniSEQ 二代測(cè)序。測(cè)序所得FASTQ 原始數(shù)據(jù)利用NGSengine （GenDx）分析后得到HLA 分型結(jié)果。

1.3 HLA 抗體測(cè)定：使用HLA 特異性抗體檢測(cè)試劑盒（流式細(xì)胞儀-微珠法），試劑盒內(nèi)的反應(yīng)微珠按著交叉反應(yīng)組的規(guī)則包被了不同的HLA-Ⅰ類（HLA-A、HLA-B） 和Ⅱ類（HLA-DR、HLA-DQ）重組抗原，將待測(cè)血清與包被了特異性抗原的微珠加入到微孔板中，經(jīng)過30 min 孵育，若血清中存在HLA 抗體則可與微珠上的抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。利用抽真空方法洗滌除去沒有結(jié)合的抗體或其他雜質(zhì)，再加入PE 標(biāo)記的二抗再次孵育30 min。通過Luminex 平臺(tái)獲取特異性結(jié)合微珠的熒光信號(hào)。

2 結(jié) 果

2.1 病例1：男性，現(xiàn)年48 歲，8 年前因慢性腎臟病5 期于外院接受了1 例車禍捐獻(xiàn)者供腎，圍術(shù)期免疫誘導(dǎo)方案為抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白+甲潑尼龍，術(shù)后規(guī)律服用他克莫司+嗎替麥考酚酯+強(qiáng)的松三聯(lián)抗排斥反應(yīng)治療。2019 年因肺部感染至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，停用抗排斥反應(yīng)藥物2 月余后發(fā)現(xiàn)血清肌酐（serum creatinine，Scr）升高，免疫抑制沖擊治療無效并開始規(guī)律血液透析，3 次/周。2021 年4 月，患者診斷為“移植腎功能不全尿毒癥期”，欲再次腎移植至南方醫(yī)院就診；血清尿素氮（serum urea nitrogen，BUN）為37.9 mmol/L，Scr 為1075 μmol/L，尿酸為525 μmol/L；移植腎及移植腎血管彩色多普勒檢查顯示移植腎體積偏小，實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)；CT 全腹平掃顯示移植腎血管硬化伴移植腎小囊腫；復(fù)查PRA（+），遂行移植腎切除術(shù)。病理結(jié)果顯示大部分腎小球萎縮、透明變性、纖維化，腎小管周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞增生致內(nèi)膜顯著增厚，管腔狹窄閉塞，符合局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）表現(xiàn)（圖1），C4d（-）。由于供者HLA 信息缺失，一部分移植腎組織被用于供受者HLA 分型（表1），結(jié)合HLA抗體檢測(cè)結(jié)果（表2）擬診為DSA 介導(dǎo)的C4d（-）AMR。術(shù)后繼續(xù)維持血透治療，目前患者生存情況良好，等待再次移植中。

圖1 病例1 移植腎組織病理鏡檢結(jié)果（HE 染色和C4d 免疫組化）

表1 病例1 供受者高分辨HLA 分型結(jié)果

表2 病例1 HLA 抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 病例2：男性，現(xiàn)年54 歲，6 年前因慢性腎臟病5 期于外院接受了1 例腦死亡捐獻(xiàn)者供腎。圍術(shù)期免疫誘導(dǎo)方案為抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白+甲潑尼龍，他克莫司+麥考酚酸+強(qiáng)的松三聯(lián)抗排斥反應(yīng)維持治療?；颊咝g(shù)后出現(xiàn)移植腎功能延遲恢復(fù)，經(jīng)血液透析治療后移植腎功能好轉(zhuǎn)出院，Scr水平維持在130 μmol/L 左右。2020 年1 月患者隨診時(shí)尿蛋白（+），予雷公藤多甙治療，效果欠佳；2021 年5 月復(fù)查尿蛋白（+++），Scr 為142 μmol/L，尿酸為429 μmol/L。移植腎及移植腎血管彩色多普勒檢查顯示移植腎內(nèi)各級(jí)動(dòng)脈阻力指數(shù)輕度升高，結(jié)合爬行肌酐和蛋白尿等，符合移植腎穿刺指征。病理活檢結(jié)果顯示移植腎符合非特殊型FSGS 伴中度慢性腎小管-間質(zhì)損傷，C4d （-）。由于供者HLA 信息缺失，一部分移植腎組織被用于供受者HLA 分型（表3），HLA 抗體檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示DSA（-）。予甲潑尼龍沖擊治療3 d，復(fù)查血肌酐降至125 μmol/L，尿蛋白（+），目前患者生存情況良好。

表3 病例2 供受者高分辨HLA 分型結(jié)果

表4 病例2 HLA 抗體檢測(cè)結(jié)果

為驗(yàn)證該技術(shù)的可靠性，我們從1 例常染色體隱性多囊腎患者的腎切除組織石蠟切片中提取DNA，并按本研究的方法對(duì)其HLA 進(jìn)行分型，結(jié)果與既往傳統(tǒng)方法得出的HLA 分型一致。

3 小 結(jié)

AMR 是腎移植術(shù)后的一種嚴(yán)重并發(fā)癥［1-3］，在1% ～ 10%的腎移植受者中造成近期和長期的移植物損傷［4］。其中，新發(fā)DSA 及其持續(xù)存在的狀態(tài)被認(rèn)為是造成急性或慢性AMR 的關(guān)鍵因素［5］。DSA 可分為HLA 抗體和包括抗ABO、抗次要組織相容性復(fù)合物（MiHA）等在內(nèi)的其他非HLA 抗體，其中HLA 抗體起主導(dǎo)作用［6］。在腎移植領(lǐng)域，HLA 抗體產(chǎn)生的主要原因?yàn)楣┱逪LA 與受者不相容。在免疫抑制不足的情況下出現(xiàn)新發(fā)DSA，多為HLA-Ⅱ類抗體，包括DR、DP 和DQ 等位點(diǎn)抗體［7］。

圖2 病例2 移植腎組織病理鏡檢結(jié)果（HE 染色和C4d 免疫組化）

PRA 可在一定程度上提示潛在或進(jìn)展中的AMR，但相較于DSA 而言，并不意味著絕對(duì)的免疫風(fēng)險(xiǎn)，且腎移植術(shù)后PRA 陽性群體中DSA 陽性患者的移植腎功能和長期存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DSA陰性的患者［8-9］。本組2 例患者均在隨訪過程中丟失供者HLA 信息。我院接診時(shí)表現(xiàn)為移植物功能不全、蛋白尿，PRA（+）。病例1、2 移植腎穿刺病理均顯示C4d（-）。結(jié)合DSA 判讀結(jié)果可確定病例1 存在DSA 介導(dǎo)的AMR，患者肌酐維持1000 μmol/L 以上并大量蛋白尿，遂予以移植物切除；病例2 雖有陽性的Ⅱ類HLA 抗體，但均不屬于DSA，可能由既往輸血引起，適當(dāng)增加免疫抑制后血肌酐顯著回落。因此，DSA 的判讀在AMR 的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中起到不可替代的作用［10-11］。

對(duì)于擬接受再次移植的患者來說，DSA 的判讀和首次移植HLA 配型相合情況決定了再次移植的供者錯(cuò)配可接受性、再次移植風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和術(shù)前準(zhǔn)備方案［12］。例如，病例1 為HLA-Ⅱ類DSA 陽性受者，當(dāng)考慮再次移植時(shí)，應(yīng)當(dāng)首選HLA-Ⅱ類位點(diǎn)相容率高的供者，其中DQ 位點(diǎn)應(yīng)完全相容；對(duì)于HLA-Ⅰ類和Ⅱ類DSA 滴度都較高的患者，術(shù)后超急性排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較大，根據(jù)《再次腎移植技術(shù)操作規(guī)范（2019 版）》，予以血漿置換、IVIG 應(yīng)用和利妥昔單抗應(yīng)用的脫敏預(yù)處理［13］。

傳統(tǒng)的DSA 檢測(cè)方法基于細(xì)胞學(xué)的表現(xiàn)，需使用25 ～ 60 個(gè)真實(shí)的供者來源淋巴細(xì)胞以代表供者的HLA 表型分布，然后加入受者的血清檢測(cè)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用［14］。該方法受制于來自于供者的細(xì)胞樣本，僅適用于移植前的DSA 檢測(cè)，且假陽性、假陰性率均較高［15］。此后問世的酶聯(lián)免疫 吸 附 技 術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）［16］和隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的基于固相的Luminex 分析系統(tǒng)［17］可以高敏感、高通量地測(cè)定供者體內(nèi)Ⅰ類、Ⅱ類HLA 抗體，但DSA 的判讀仍需結(jié)合供者的HLA 分型信息，尚不能完全滿足日益增多的供者HLA 分型信息缺失受者的需要。

Liu 等［18］從受者中段尿中分離、培養(yǎng)供者來源細(xì)胞，提取DNA 并對(duì)供者HLA 基因進(jìn)行測(cè)序與分型。該方法的突出特點(diǎn)為無創(chuàng)與安全，具有很大的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)學(xué)研轉(zhuǎn)化。但由于該方案涉及細(xì)胞培養(yǎng)過程，對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，耗時(shí)較長、較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且費(fèi)用昂貴，推廣仍具有一定難度。

本研究適用于移植腎穿刺組織進(jìn)行HLA 的鑒定，可利用新鮮組織或石蠟切片，雖為有創(chuàng)操作，但用量僅為1 mm3且無皮髓質(zhì)的部位要求，對(duì)臨床癥狀顯著、具有病理活檢指征的可疑AMR 移植受者并未增加額外的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。該方法中的組織消化和DNA 提取流程簡便，較尿沉渣［19］而言，抽提DNA 質(zhì)量更高且穩(wěn)定，可滿足HLA 分型需要，最快96 h 內(nèi)可報(bào)告結(jié)果，為臨床診療爭取了更多的時(shí)間。雖然該方法無法區(qū)分與受者完全相同的供者HLA 分型，但該方法的目的本身就是鑒定不相容的HLA 位點(diǎn)，因此當(dāng)DNA 含量不足時(shí)低分辨HLA 分型也能滿足臨床需求，而高分辨HLA 分型技術(shù)的應(yīng)用則會(huì)大大降低該情況出現(xiàn)的可能［20］。

綜上，本文總結(jié)了一種在供者HLA 分型信息缺失情況下，利用移植腎活檢組織對(duì)供者進(jìn)行HLA 分型從而判定DSA 存在的方法，為跨地域、跨醫(yī)療中心就醫(yī)的移植腎受者隨診工作提供必要的技術(shù)支持。對(duì)于可疑AMR 患者，應(yīng)當(dāng)結(jié)合供受者HLA 分型、DSA 判讀與病理活檢結(jié)果，以作出準(zhǔn)確的臨床診斷，指導(dǎo)患者的精準(zhǔn)治療。