嚴(yán)皓敏，潘崎，余梓桐，程穎（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植暨肝膽外科，遼寧沈陽，110001）

肝移植是目前治療終末期肝病的唯一有效方法［1-3］。每年都會(huì)有許多移植等待名單上的患者由于捐贈(zèng)資源短缺失去了生命。因此，很有必要充分利用心臟死亡后器官捐獻(xiàn)（donation after circulatory death，DCD）來擴(kuò)大捐贈(zèng)來源［4-5］。根據(jù)器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)（United Network for Organ Sharing，UNOS）的數(shù)據(jù)，美國DCD 捐贈(zèng)者在所有移植捐贈(zèng)者中的比例穩(wěn)步上升，從2008 年的6.29%上升到2018 年的12.14%。肝移植供肝捐贈(zèng)比例從6.25%上升至8.61%。在英國，2014 年至2015 年度1282 例已故器官捐贈(zèng)者中有570 例為DCD 捐贈(zèng)者［6］。與腦死亡后器官捐獻(xiàn)（donation after brainstem death，DBD）相比，DCD 來源的器官從心臟停搏到確認(rèn)死亡通常會(huì)經(jīng)歷一段灌注不良的時(shí)期，這會(huì)給器官帶來性更多的缺血損傷，從而極大地影響了器官的活性［7］。與其他器官相比，肝臟通常更容易受到缺血的影響，這也解釋了為什么源于DCD 的供肝質(zhì)量不及其他器官［8-10］。盡管如此，仍有研究表明DCD肝移植仍然可以為患者提供了生存優(yōu)勢［11］。Scalea等［12］的一項(xiàng)研究表明，選擇冷缺血時(shí)間短的年輕DCD 供者的肝臟可能會(huì)產(chǎn)生更好的移植結(jié)果。隨著新的器官保存和復(fù)蘇的技術(shù)正在不斷進(jìn)步［13-17］，包括常溫灌注、低溫充氧灌注、體外再灌注和復(fù)蘇，DCD 的移植物質(zhì)量有望得到進(jìn)一步改善。

大多數(shù)DCD 供肝源于Maastricht 分類Ⅲ類捐贈(zèng)者，這部分患者往往在重癥監(jiān)護(hù)病房或急診室等待生命維持治療的停止（withdrawal of life-sustaining therapy，WLST）。然而，目前對于WLST 過程本身是否會(huì)對供體器官質(zhì)量產(chǎn)生影響還沒有確定的結(jié)論。此前有幾項(xiàng)使用大型動(dòng)物模型來研究誘導(dǎo)心臟驟停的研究中大多采用心臟除顫或使用心臟停搏藥物的方式使得供體模型安樂死［18-21］，然而這在臨床上是不能進(jìn)行的。還有一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪峭ㄟ^夾閉胸主動(dòng)脈的方式來建立的不可控的DCD 豬模型［15］。這些模型顯然不能用于模擬臨床上肝移植前可控DCD 的狀況。因此，為了更好地研究供體從撤離呼吸機(jī)至循環(huán)死亡過程中供體肝臟的變化，在本研究中，我們利用巴馬小型豬建立了一種可控的撤離呼吸機(jī)模型。通過這一模型和過程，我們研究了撤除呼吸機(jī)階段體循環(huán)的變化以及熱缺血時(shí)間（warm ischemia time，WIT）對供體模型肝臟組織活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照“動(dòng)物管理指南”進(jìn)行，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選用16 只巴馬小型豬，雌雄各8 只，體重均在45 ～ 55 kg，購自天津市實(shí)驗(yàn)小型豬繁育中心。

這些動(dòng)物在手術(shù)前禁食24 h，充分補(bǔ)充水分。術(shù)前給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌注咪唑安定（0.2 mg/kg）和阿托品（0.2 mg/kg），氣管插管前20 ～ 30 min 用速眠新Ⅱ號(hào)（0.1 ml/kg）鎮(zhèn)靜以及使用異氟醚（100%氧氣中1% ～ 2%）麻醉。

應(yīng)用頸動(dòng)脈和靜脈插管方式分別監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈壓（arterial blood pressure，ABP）和中心靜脈壓（central venous pressure， CVP）。用血?dú)夥治鰞x（GEM Premier 3000）進(jìn)行血?dú)夥治?，同時(shí)連續(xù)監(jiān)測心電圖。

采用窒息法建立豬DCD 模型。加用異丙酚（500 mg/10 ml）和羅庫溴銨（100 mg/10 ml）使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物維持適當(dāng)程度的持續(xù)麻醉。通氣維持在15 b/min 的呼吸頻率，最大呼吸壓低于25 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）。建立模擬臨床過程的窒息模型，通過拔除氣管導(dǎo)管來切斷通氣并且將該時(shí)間點(diǎn)定義為“撤機(jī)零點(diǎn)”。心電圖監(jiān)測顯示心臟無電活動(dòng)或臨界低收縮壓（SBP ＜50 mmHg）為供體心臟死亡的循環(huán)指征，標(biāo)志著WIT 開始。臨床上大多將器官WIT 定義為自撤除生命支持至原位主動(dòng)脈冷灌注這段時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)不涉及后續(xù)冷灌注，因此將WIT 定義為豬模型自心臟死亡開始后的相關(guān)時(shí)長，本實(shí)驗(yàn)僅觀察WIT 延長至60 min 的豬模型的相關(guān)變化。

1.2 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測：在整個(gè)手術(shù)過程中監(jiān)測血流動(dòng)力學(xué)和生化參數(shù)。模型存活時(shí)間（min）定義為從撤除呼吸機(jī)零點(diǎn)到確認(rèn)動(dòng)物模型心臟死亡的時(shí)間。每隔5 min 記錄心率（heart rate，HR），血?dú)夥治觯憾趸挤謮海╬artial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、氧分壓（oxygen partial pressure，PaO2）、平均動(dòng)脈壓（mean artery pressure，MAP）、中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和血pH 值。

1.3 肝臟的病理檢查：光鏡下可檢測內(nèi)容包括血栓/出血、肝細(xì)胞腫脹、微泡性脂肪變性、細(xì)胞凋亡和壞死等形態(tài)學(xué)改變。電鏡可觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體質(zhì)膜完整性、染色質(zhì)邊集和凝聚等情況。

1.3.1 光學(xué)顯微鏡檢測方法：從WIT 開始到WIT后30 min，每5 min 取一次肝組織活檢。組織用磷酸鹽緩沖液洗凈，用10%福爾馬林固定至少24 h，以石蠟包埋，以5 μm 厚度切片。隨后，切片脫蠟，再水化，蘇木精伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色檢查。

1.3.2 電子顯微鏡方法：分別于WIT-0 min、WIT-30 min、WIT-60 min 取體積為1 mm3的肝活檢標(biāo)本，用Trump’s 固定劑固定，在20℃的溫度下用1%四氧化二釤和碳酸氫鈉緩沖液后固定3 h，用5%醋酸鈾酰水溶液整塊染色。厚片（1 m）用甲苯胺藍(lán)染色。用LKB8801 超微切片機(jī)（LKB，瑞典斯德哥爾摩）從厚片上切下50 ～70 nm 的薄片，以醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。所有樣品均用透射電子顯微鏡（飛利浦EM201）檢查和拍照。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均存活時(shí)間為17.94（11.3 ～24.5）min。在模型撤除呼吸機(jī)后的最初5 min 內(nèi)，我們觀察4 個(gè)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)值均升高，如圖1 所示，包括MAP、CVP、DBP 和SBP。其中SBP 中尤為突出。除CVP 在10 min 后開始下降外，其他所有指標(biāo)都開始下降。心率也在撤除呼吸機(jī)后的前5 min 內(nèi)升高，之后下降（圖2）。撤 除 呼 吸 機(jī) 后5 min 內(nèi)PaO2急 劇 下 降（圖3），10 min 后逐漸降至0 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。PaCO2值與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液pH 值呈負(fù)相關(guān)（圖4），這歸因于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液中碳酸含量逐漸增加。

圖1 血流動(dòng)力學(xué)變化趨勢

圖2 HR 隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的變化

圖3 血?dú)夥治鲇脕肀O(jiān)測PaCO2 和PaO2

圖4 pH 值變化

2.2 肝臟熱缺血損傷的組織學(xué)評價(jià)

2.2.1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果：如圖5 所示，我們發(fā)現(xiàn)隨著WIT 的延長，組織損傷程度逐漸嚴(yán)重。在WIT 的前10 min（圖5B、5C 與5A 相比），實(shí)質(zhì)內(nèi)肝細(xì)胞僅有輕微腫脹，血管內(nèi)的微血栓很容易被觀察到。WIT-15 min 時(shí)（圖5D），中心靜脈周圍可見放射狀中心性水腫。中心靜脈附近也可見炎性細(xì)胞。部分肝細(xì)胞表現(xiàn)出微泡性脂肪變性。凋亡肝細(xì)胞內(nèi)可見嗜酸性小體，肝竇內(nèi)可見5 ～8 個(gè)紅細(xì)胞壞死。WIT-20 min 時(shí)（圖5E），肝細(xì)胞和間質(zhì)狀況惡化，細(xì)胞腫脹加重，可見出血，并有局灶性或片狀壞死，細(xì)胞核出現(xiàn)標(biāo)志細(xì)胞發(fā)生壞死裂解。WIT-25 min（圖5F），細(xì)胞腫脹加重，可見肝細(xì)胞空泡化，斑片狀壞死明顯。雖然中心靜脈附近出血和脂肪變性加重，但門靜脈區(qū)域結(jié)構(gòu)保持完整。撤除呼吸機(jī)后30 min（圖5G），大部分細(xì)胞出現(xiàn)膨脹，細(xì)胞間隙充滿紅細(xì)胞。大部分區(qū)域可見片狀壞死，脂肪變性加重。大量細(xì)胞壞死裂解，出現(xiàn)大量細(xì)胞核。

圖5 組織學(xué)評價(jià)

2.2.2 電子顯微鏡：在WIT 剛開始時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體呈圓形，內(nèi)膜清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊未見明顯的染色質(zhì)邊集或凝聚（圖6A）。WIT 延長至30 min 時(shí)，可見肝細(xì)胞呈廣泛的空泡化，線粒體結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)膜模糊。大多數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹（圖6B）。WIT 延長至60 min 時(shí)，電鏡下可見許多肝細(xì)胞出現(xiàn)了壞死。在相當(dāng)數(shù)量的肝細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體甚至整個(gè)細(xì)胞都呈現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化。線粒體整體密度降低，同時(shí)線粒體內(nèi)可見大量電子致密沉淀物（圖6C）。大多數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)邊集和凝集。結(jié)果顯示W(wǎng)IT 控制在30 min 內(nèi)對肝細(xì)胞的損傷呈現(xiàn)可逆，而WIT 延長至60 min 后肝細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不可逆的損傷，表現(xiàn)為廣泛的嚴(yán)重空泡化和明顯的染色質(zhì)凝聚（圖6C）。

圖6 電鏡觀察下的亞分子結(jié)構(gòu)

3 討 論

根據(jù)心臟驟停的情況，Maastricht 分類系統(tǒng)將DCD捐贈(zèng)者分為兩類：可控（Ⅰ和Ⅱ類）和不可控（Ⅲ和Ⅳ類）［22］。目前臨床上大多數(shù)DCD 捐贈(zèng)者被歸類為Ⅲ類，即循環(huán)系統(tǒng)死亡發(fā)生在WLST 之后。從WLST開始到確認(rèn)死亡再到最終獲得器官，總會(huì)經(jīng)歷一段時(shí)間，這會(huì)導(dǎo)致不可避免的高血壓和全身性低灌注的狀態(tài)。在這個(gè)WIT 內(nèi)，供體器官在沒有血液和氧氣供應(yīng)的情況下，在體溫下會(huì)仍然在經(jīng)歷高代謝狀態(tài)。

與DBD 供體相比，DCD 供體通常會(huì)經(jīng)歷較長的WIT，因?yàn)榇_認(rèn)心臟死亡需要更多的時(shí)間，這可能會(huì)導(dǎo)致DCD 捐贈(zèng)者的器官遭受更嚴(yán)重的缺血性損傷［23-25］。目前已經(jīng)有許多研究利用人類［23-25］以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?6-27］發(fā)現(xiàn)了長時(shí)間WIT 對器官的不利影響。然而，從停止生命維持治療到宣布循環(huán)死亡的這個(gè)過程中，有關(guān)供者循環(huán)系統(tǒng)的全身性變化以及這段WIT 對器官的影響還沒有得到詳細(xì)的描述。特別是在豬DCD 窒息模型的研究中，鮮有研究涉及到停用生命支持過程中供體循環(huán)參數(shù)的波動(dòng)問題。一些研究表明，供體低收縮壓與移植的預(yù)后直接相關(guān)，而WIT 時(shí)間跨度與移植物活性呈負(fù)相關(guān)［20，26-27］。在Ho 等［28］的一項(xiàng)研究中提出，供者SBP 降至50 mmHg 以下的持續(xù)時(shí)間對移植物存活至關(guān)重要。在本研究中，我們重點(diǎn)關(guān)注了在這一過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身血壓、氧氣供應(yīng)以及肝組織學(xué)的變化。

大多數(shù)已建立的大型動(dòng)物DCD 模型尚不能很好地模擬臨床情況。研究者們開發(fā)了一些方法，例如通過誘導(dǎo)心室顫動(dòng)［20］或給予高濃度的鉀［18］來誘導(dǎo)心臟驟停。在Banan 等［29］的研究中，通過靜脈注射氯化鉀誘導(dǎo)心臟驟停，并將WIT 定義為腹腔內(nèi)阻斷到開始常溫體外肝臟灌注（normothermic extracorporeal liver perfusion，NELP）之間的時(shí)間。事實(shí)上，當(dāng)捐贈(zèng)者停止生命維持治療時(shí)，器官會(huì)經(jīng)歷一段緩慢而漸進(jìn)的缺血損傷時(shí)間直到心臟驟停，期間供體氧氣供應(yīng)隨之減少。在我們的研究中，該模型非常接近臨床上DCD 捐贈(zèng)者停止生命維持治療后的情景。我們采用了被動(dòng)的方法，通過切斷通氣來誘導(dǎo)心臟驟停，從而允許對內(nèi)臟的氧氣輸送和灌注可以緩慢而逐漸地減少。我們發(fā)現(xiàn)，從切斷通氣到確認(rèn)心臟死亡之間的時(shí)間間隔并不恒定，這可能會(huì)導(dǎo)致WIT 時(shí)長的不確定性。因此，傳統(tǒng)的心臟死亡標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)開始定義的WIT 可能不能準(zhǔn)確地反映供體器官真實(shí)的遭受熱缺血損傷的時(shí)間。供體模型SBP在撤除呼吸機(jī)前5 min 升高，之后明顯下降，撤除呼吸機(jī)后15 min 降至50 mmHg 以下。同時(shí)，撤除呼吸機(jī)10 min 后，血氧分壓降至0 mmHg。我們定義的WIT 始于心臟死亡的確認(rèn)，實(shí)際上移植物所經(jīng)歷的WIT 可能會(huì)更長。然而，不論WIT 如何定義，移植物的狀況都可能受到額外的不確定WIT 的影響。

組織學(xué)研究結(jié)果表明，隨著WIT 的延長，供肝組織遭受的損傷也更嚴(yán)重。我們在不同的時(shí)間點(diǎn)可以觀察到不同程度的肝竇擴(kuò)張、肝細(xì)胞腫脹和空泡化。這些發(fā)現(xiàn)與之前的一些相關(guān)性研究［30-31］是一致的。值得注意的是，肝細(xì)胞同時(shí)發(fā)生了細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的改變。這些變化是在再灌注前發(fā)現(xiàn)的，這表明減少WIT 對移植物的保存至關(guān)重要。

目前，已有相關(guān)臨床研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)WIT 超過30 min 被認(rèn)為是引起移植物進(jìn)一步丟失的危險(xiǎn)因素［32-35］。一項(xiàng)Sher 等［36］基于UNOS 數(shù)據(jù)對DCD供體的調(diào)查研究中表明美國大多數(shù)器官移植中心可接受的WIT 不超過30 min。國內(nèi)有關(guān)豬肝移植時(shí)無心跳供體可耐受WIT 的研究中也認(rèn)為安全時(shí)限為30 min，然而該研究中有關(guān)不同熱缺血時(shí)長所致供肝熱缺血損傷病理變化重點(diǎn)是于再灌注1 h 之后觀察的［37］。然而之前Takada 等［38］研究認(rèn)為豬肝移植可耐受的WIT 長達(dá)60 min，其結(jié)論主要基于其研究結(jié)果顯示W(wǎng)IT 長達(dá)1 h 供肝的移植術(shù)后生存率可達(dá)80%。然而在國內(nèi)相似研究［39］中，心臟死亡確定后60 min 供肝肝移植術(shù)后卻無存活。有關(guān)熱缺血安全時(shí)限報(bào)道差異較大，可能是由于評判標(biāo)準(zhǔn)，以及手術(shù)方法等差異，還需進(jìn)一步研究。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，主要是通過對組織學(xué)結(jié)果評價(jià)可耐受的熱缺血時(shí)長，結(jié)果表明WIT 在30 min 內(nèi)供肝組織的損傷尚且可逆，至60 min 則不可逆。目前供肝資源短缺，有關(guān)熱缺血時(shí)限的研究有助于進(jìn)一步擴(kuò)大DCD 供肝來源，Paterno 等［40］有關(guān)WIT 對受體預(yù)后的研究結(jié)果表示W(wǎng)IT 在30 ～40 min，移植存活率無明顯差異。這一研究結(jié)果也提示有關(guān)供肝WIT 的篩選條件可適當(dāng)放寬，以進(jìn)一步擴(kuò)大捐贈(zèng)來源以及移植機(jī)會(huì)。

我們建立了一種模擬人類DCD 的心臟驟停的大型動(dòng)物模型并觀察和記錄了在這個(gè)過程中供體血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和供肝組織學(xué)的變化。我們的研究表明，從停止生命支持治療到確認(rèn)心臟死亡的這個(gè)緩慢過程可能會(huì)使移植物承受額外的缺血性損傷。

我們的研究還存在一些局限性。實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物是健康的豬，而DCD 捐贈(zèng)者通常有嚴(yán)重的腦損傷，盡管不是致命的。這種差異是否會(huì)對DCD供者所經(jīng)歷的缺氧過程產(chǎn)生影響，還需進(jìn)一步研究。此外，雖然實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以在切斷通氣后立即停止呼吸，但DCD 捐贈(zèng)者可能在窒息死亡之前能夠自主呼吸一段時(shí)間。因此，存在著一個(gè)未知的時(shí)間段，這段時(shí)間內(nèi)盡管供體處在缺氧狀態(tài)中，但循環(huán)仍在發(fā)生，這可能會(huì)使所獲得的器官的質(zhì)量評估進(jìn)一步復(fù)雜化。本研究的樣本量不大，可能會(huì)限制數(shù)據(jù)的可靠性。今后的研究將致力于使用該DCD 供體模型進(jìn)一步建立機(jī)械灌注干預(yù)恢復(fù)的全程移植模型，研究移植物的缺血/再灌注損傷，探討不同操作方式與移植結(jié)果的相關(guān)性。

以上，我們建立了一類豬DCD 模型，通過給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物撤除呼吸機(jī)可以更好地模擬臨床Maastricht Ⅲ類。我們發(fā)現(xiàn)，在撤除呼吸機(jī)之后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血壓立即升高，但之后會(huì)持續(xù)下降。而PaO2迅速下降，PaCO2相應(yīng)上升并達(dá)到平臺(tái)期。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)WIT 對供體肝組織完整性有直接影響。WIT在30 min內(nèi)的組織損傷可能仍是可逆的，而WIT 達(dá)到60 min 時(shí)的組織損傷則不可逆。