夏文秀，吳方麗，侯 穎，張廣維，黨瑞杰，李 琳

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD)是一種以肝臟脂肪代謝紊亂及脂肪過度沉積為主要特征的代謝應(yīng)激性肝損傷，是代謝綜合征在肝臟的主要表現(xiàn)。全世界NAFLD患病率高達(dá)25%。脂肪變性是NAFLD的初始階段，與胰島素抵抗和血脂異常顯著相關(guān)，亦有可能發(fā)展為不可逆性肝硬化和肝癌。采用藥物緩解肝臟脂肪變性并探討相關(guān)分子機(jī)制對(duì)于防治NAFLD具有非常重要的臨床意義。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是大麻素類天然化合物，其完全不具有精神活性。大麻素能調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖的代謝，CBD能緩解肝纖維化和肝臟炎癥，還能減輕酒精誘導(dǎo)脂肪肝病中的肝臟損傷。但CBD對(duì)NAFLD是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制仍不清楚。老齡鼠更容易發(fā)生胰島素抵抗。因此，本研究以老齡小鼠為模型，探討CBD對(duì)高脂飲食老齡小鼠肝臟脂肪變性的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 15月齡雄性C57BL/6J小鼠(維通利華，北京)；CBD (CATO， 美國(guó))；抗腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)抗體(#5832；CST，美國(guó))、磷酸化(p)-AMPK抗體(#2535；CST， 美國(guó))；乙酰輔酶A羧化酶(ACC)抗體(Ab45174；Abcam，英國(guó))、p-ACC抗體(Ab68191；Abcam，英國(guó))；β-actin抗體(BM0627；博士德，中國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒(博士德，中國(guó))；qRT-PCR試劑盒(Takara，日本)；蛋白電轉(zhuǎn)、電泳設(shè)備(Bio-Rad， 美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(FTC-3000P，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)；便攜式血糖儀及試紙(One Touch，美國(guó))；自動(dòng)生化分析儀(日立，日本)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(R&D Systems， 美國(guó))；比色分析試劑盒(南京建成，中國(guó))；顯微鏡(奧林巴斯， 日本)。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組 30只15月齡雄性C57BL/6J小鼠在中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為三組：正常飲食組(NC組；普通飼料；=10)、高脂飲食組(HFD組；60%高脂飼料；=10)和CBD治療組[CBD組；60%高脂飼料，腹腔注射CBD(10 mg/kg， 每周3次)；=10]。12周后，所有小鼠禁食過夜并實(shí)施安樂死后采集樣本。

1.3 血清中相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 生化分析儀測(cè)定血清中葡萄糖、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定血清中胰島素水平。比色分析試劑盒測(cè)定游離脂肪酸(FFA)。

1.4 組織學(xué)檢測(cè) 小鼠肝臟組織標(biāo)本于4%多聚甲醛中固定。使用冷凍切片機(jī)將組織切成5 μm厚的切片，油紅O染色，在顯微鏡下觀察肝臟的組織學(xué)變化。

1.5 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT) 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)前，三組小鼠禁食15 h，腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)前，將三組小鼠禁食5 h，腹腔注射胰島素(0.75 U/kg)。分別在葡萄糖及胰島素注射后15、30、 60 、90、120 min，尾靜脈采血法及便攜式血糖儀測(cè)定小鼠的血糖濃度，繪制IPGTT及ITT曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC)。

1.6 相關(guān)基因mRNA檢測(cè) 取小鼠肝臟組織，液氮速凍后研磨并使用TRIzol試劑提取總RNA，測(cè)定RNA濃度后定量1 μg RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)、ApoE、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚堿轉(zhuǎn)移酶1a(CPT1a)的mRNA表達(dá)；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；40個(gè)循環(huán)： 95 ℃持續(xù) 15 s， 60 ℃持續(xù)15 s，72 ℃持續(xù) 15 s。相關(guān)引物均由上海生工合成(表1)。

1.7 Western blot檢測(cè) 取小鼠肝臟組織，液氮速凍后研磨并使用RIPA裂解液提取組織蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后定量30 μg蛋白。隨后進(jìn)行蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后將PVDF膜在室溫封閉1 h，接下來按照1∶1000的濃度配置一抗：AMPK、p-AMPK、ACC和p-ACC，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF膜在二抗中室溫孵育1 h，使用TBST洗膜3次后使用顯影劑觀察條帶上蛋白的表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 CBD對(duì)老齡小鼠代謝特征的影響 HFD組的血糖水平、胰島素水平、TG、TC、FFA、ALT和AST的含量相比于NC組小鼠均顯著升高(<0.05)，CBD組的上述代謝相關(guān)參數(shù)的水平顯著減低，提示CBD能改善HFD小鼠的糖脂代謝紊亂(表2)。

2.2 CBD對(duì)老齡小鼠肝臟脂肪變性的影響 油紅O染色發(fā)現(xiàn)，與NC組小鼠比較，HFD組小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)存在明顯脂滴，CBD組紅染脂滴數(shù)量明顯變少，提示CBD可以減輕HFD小鼠的肝臟脂肪變性(圖 1)。

2.3 CBD對(duì)老齡小鼠葡萄糖處理能力的影響 IPGTT和ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組小鼠相比，HFD組小鼠葡萄糖和胰島素耐量受損，CBD干預(yù)能夠部分恢復(fù)高脂飲食小鼠的葡萄糖處理能力(圖2)。

2.4 CBD調(diào)節(jié)老齡小鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平(表3)，與NC組小鼠相比，HFD組小鼠中脂肪生成相關(guān)基因：FAS和 SREBP1c表達(dá)水平均顯著上調(diào)，CBD干預(yù)顯著降低了FAS和SREBP1c的mRNA表達(dá)水平。HFD組小鼠參與脂質(zhì)分泌的基因ApoE及與脂肪氧化相關(guān)的PPARα及CPT1a的表達(dá)受到抑制，CBD能增加這些基因的mRNA表達(dá)水平。

2.5 CBD激活A(yù)MPK/ACC信號(hào)通路 Western blot檢測(cè)三組老齡小鼠中p-AMPK及p-ACC蛋白的表達(dá)情況(圖3)。在HFD組小鼠中，p-AMPK及p-ACC蛋白表達(dá)水平顯著降低(<0.05)。CBD干預(yù)后，與HFD組相比，p-AMPK及p-ACC蛋白的表達(dá)水平顯著升高(<0.05)。

3 討 論

隨著我國(guó)人民生活水平的顯著提高，NAFLD的發(fā)病率逐年增高，已取代慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。肝臟脂肪變性是NAFLD的初始病理階段，尚無明確有效的治療藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，CBD可以顯著改善老齡小鼠中糖脂代謝相關(guān)參數(shù)，降低胰島素敏感性，降低肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，進(jìn)而減輕小鼠肝臟脂肪變性。同時(shí)，CBD改善脂質(zhì)代謝相關(guān)mRNA的表達(dá)水平，提高AMPK和ACC的磷酸化水平，表明CBD對(duì)老齡小鼠肝臟脂肪變性的發(fā)揮，AMPK/ACC信號(hào)通路參與了這一過程。

糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要臨床表現(xiàn)，與胰島素抵抗、血脂異常顯著相關(guān)。在本研究中，我們檢測(cè)了不同組間小鼠糖脂代謝相關(guān)參數(shù)的變化，結(jié)果表明，CBD顯著降低了HFD老齡小鼠的血糖水平、胰島素含量、TG、TC、FFA、ALT及AST的水平。同時(shí)，CBD干預(yù)提高了HFD老齡小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，改善胰島素抵抗。

脂代謝涉及脂質(zhì)合成、分泌和氧化分解等過程。在脂質(zhì)合成代謝中， SREBP-1c是調(diào)節(jié)與肝臟脂肪合成相關(guān)酶的活性和表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其能促進(jìn)脂肪酸合成代謝。FAS是體內(nèi)合成內(nèi)源性脂肪酸的關(guān)鍵酶之一， 能被SREBP-1c激活，將多余的能量以三酰甘油的形式儲(chǔ)存在脂肪組織中，進(jìn)而促進(jìn)肝臟脂肪合成。在脂質(zhì)分解代謝中，PPARα則能通過激活脂肪氧化基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪酸氧化，從而促進(jìn)脂肪的降解，其表達(dá)的異常與許多脂代謝性疾病有關(guān)。CPT1a 能與長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成脂酰肉堿，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體而促進(jìn)其氧化分解。 ApoE是血漿中重要的載脂蛋白，具有轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，調(diào)節(jié)脂類代謝的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，qRT-PCR顯示HFD老齡小鼠中SREBP-1c及FAS的表達(dá)水平顯著升高，而PPARα、CPT1a及ApoE的轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制，表明經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)的老齡小鼠，脂肪合成被活化而脂肪分解代謝被顯著抑制。CBD干預(yù)能顯著降低SREBP-1c及FAS，并提高PARPα、CPT1a及ApoE的mRNA表達(dá)水平，證明在HFD老齡小鼠中，CBD的干預(yù)能抑制脂質(zhì)合成代謝并促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

ACC也是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，能被SREBP-1c激活，促進(jìn)脂質(zhì)合成并抑制脂肪酸氧化。AMPK信號(hào)通路是脂質(zhì)代謝的重要通路， AMPK在調(diào)控ACC活性中具有關(guān)鍵作用。AMPK經(jīng)磷酸化激活后，進(jìn)一步磷酸化ACC，而ACC被AMPK磷酸化后失去活性，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)的線粒體氧化，減少脂質(zhì)的沉積。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)觀察到，在HFD小鼠中，APMK和ACC的磷酸化水平受到抑制，而CBD干預(yù)促進(jìn)了p-AMPK和p-ACC的表達(dá)水平，表明CBD能激活A(yù)MPK并使下游的ACC失去活性，進(jìn)而減輕高脂喂養(yǎng)的小鼠的肝臟脂肪變性。這些結(jié)果表明，APMK/ACC信號(hào)通路參與了CBD干預(yù)改善HFD小鼠的肝脂肪變性的過程。

綜上所述，CBD能改善高脂飲食小鼠中糖脂代謝相關(guān)參數(shù)的紊亂，減輕高脂飲食的胰島素抵抗和肝臟脂肪變性，對(duì)APMK/ACC通路的激活作用可能是其發(fā)揮肝臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制。本研究仍具有一定的局限性。CBD主要通過CBD受體CB1和CB2發(fā)揮胞內(nèi)作用，但本研究未探討CBD受體在CBD緩解高脂飲食老齡小鼠肝臟脂肪變性中的作用，未采用AMPK抑制劑反證AMPK/ACC信號(hào)通路的作用，課題組將在下一步研究中繼續(xù)上述工作。