何 婧, 于海波, 王艾琳

(東北師范大學(xué) 物理學(xué)院, 長春 130024)

納米酶具有穩(wěn)定性高、 成本低和催化活性可調(diào)節(jié)等優(yōu)點, 是天然酶的良好替代品. 目前多種納米酶已被設(shè)計合成并應(yīng)用, 包括金屬納米顆粒、 金屬有機框架和氧化石墨烯等[1-5]. 此外, 碳量子點(CDs)因其優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、 低毒性和易于表面改性等優(yōu)點而引起人們廣泛關(guān)注： Datta等[6]以碳量子點為催化劑進行了電化學(xué)水氧化的研究; Safavi等[7]合成了具有過氧化物酶催化活性的碳量子點, 并用于偶氮染料降解研究; Cailotto等[8]將碳量子點用于無金屬光氧化還原催化研究; Fe2O3/CD,ZnO/CD和Au/CD等基于半導(dǎo)體/碳量子點和貴金屬/碳量子點的納米復(fù)合材料也表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性[9-11]; 當(dāng)碳量子點覆蓋在金、 銀等貴金屬納米顆粒上時, 復(fù)合材料表現(xiàn)出表面增強Raman散射(SERS)活性[12-14]; SERS可為生物化學(xué)、 生物傳感、 催化和電化學(xué)提供高靈敏度檢測[15-18].

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物. 尿酸水平異常可增加患痛風(fēng)、 關(guān)節(jié)炎、 腎臟和心血管相關(guān)疾病的風(fēng)險[19-21]. 有效檢測尿酸水平對疾病的診斷和治療具有重要意義， 傳統(tǒng)方法通過比色反應(yīng)檢測尿酸[22-24]. 過氧化氫是尿酸被尿酸酶氧化的產(chǎn)物, 在過氧化物酶的催化下, 過氧化氫可將3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化為氧化TMB(oxTMB), 同時溶液由無色變?yōu)樗{色. 比色檢測具有較高的選擇性, 但檢測的靈敏度較低, SERS可提高檢測靈敏度.

本文用CDs還原AgNO3, 合成了核殼結(jié)構(gòu)的Ag-CDs納米粒子, 其中碳殼的厚度為2.2 nm. 用透射電子顯微鏡(TEM)分析Ag-CDs納米粒子的形成過程. 與Ag納米粒子相比, Ag-CDs納米粒子具有優(yōu)異的過氧化物酶催化活性和SERS活性. 以Ag-CDs納米粒子為催化劑和以SERS為襯底, 通過協(xié)同比色反應(yīng)和增強SERS光譜檢測尿酸. Ag-CDs納米粒子可催化過氧化氫氧化TMB形成藍色的oxTMB, 尿酸可將oxTMB還原. 隨著尿酸濃度的增加, oxTMB的SERS信號逐漸降低. 比色法和SERS協(xié)同檢測方法使尿酸的檢測更可靠和準(zhǔn)確.

1 實 驗

1.1 材 料

尿素、 對苯二胺、 過氧化氫(H2O2, 體積數(shù)為30%)、 檸檬酸鈉、 NaOH和乙醇均購自國藥化學(xué)試劑有限公司, AgNO3購自阿拉丁(上海)試劑有限公司, 4-巰基苯胺(4-ATP)購自西格瑪-奧爾德里奇(上海)有限責(zé)任公司, TMB購自上海克拉馬爾試劑有限公司, 葡萄糖、 KCl和NaCl購自北京化工廠, 草酸二水合物購自天津市廣?？萍奸_發(fā)有限公司, 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N氧化物(DMOP)和尿酸購自深圳市深強科技有限公司.

1.2 儀 器

透射電子顯微鏡(THEMISZ型, 上海賽默飛世爾科技有限公司)； X射線衍射儀(UltimaⅣ型, 日本理學(xué)公司)； Fourier紅外光譜儀(Nicolet iS10型, 上海賽默飛世爾科技有限公司)； 紫外-可見分光光度計(UV2600型, 日本島津儀器有限公司)； 模塊化熒光光譜儀(QuantaMaster8000型, 法國HORIBA科學(xué)儀器公司)； Raman光譜儀(Jobin-Yvon HR800型, 法國HORIBA科學(xué)儀器公司)； 電子順磁共振波譜儀(EMX nano型, 德國布魯克科技有限公司).

1.3 Ag-CDs納米粒子的合成

利用水熱法合成CDs[25]. 先將0.12 g尿素和0.12 g對苯二胺溶解于30 mL超純水中, 再將溶液置于高壓反應(yīng)釜中, 160 ℃加熱10 h. 冷卻至室溫后, 將深棕色的CDs溶液通過微孔膜過濾, 并用水透析. 最終得到CDs溶液的質(zhì)量濃度為0.62 mg/mL. 將3 mL NaOH溶液(10 mmol/L)加入3 mL的CDs溶液(0.033 mg/mL)中, 在50 ℃水浴下加熱, 邊攪拌邊滴加3 mL AgNO3溶液(0.2 mmol/L). 將混合溶液在50 ℃加熱2 h得到Ag-CDs納米粒子. 單獨的Ag納米粒子參照文獻[26]方法合成.

1.4 SERS活性測試

以4-ATP為探針分子測試Ag-CDs納米粒子、 Ag納米粒子和CDs的SERS活性. 將4-ATP乙醇溶液(10-5mol/mL)分別滴加在3 mL的Ag-CDs納米粒子、 Ag納米粒子和CDs溶液中, 靜置1 h后, 離心除去多余的4-ATP. 最后將樣品滴在載玻片上, 測量3種基底的4-ATP SERS光譜.

1.5 類過氧化物酶的催化活性及動力學(xué)分析

先將1 mL的TMB(4 mmol/L)與1 mL過氧化氫(4 mmol/L)混合, 再將混合物分別加入0.5 mL的Ag-CDs納米粒子(0.25 mg/mL)、 CDs(11 mg/L)、 Ag納米粒子(0.25 mg/mL)和超純水中. 每2 min測量一次溶液的吸收光譜. 通過改變TMB或過氧化氫的濃度進行穩(wěn)態(tài)動力學(xué)測定. 控制過氧化氫濃度(0.8 mol/L)和Ag-CDs納米粒子的質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL), 先將TMB的濃度由0.1 mol/L逐漸調(diào)至0.8 mol/L. 再控制TMB濃度(0.8 mol/L)和Ag-CDs納米粒子的質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL), 將過氧化氫濃度從0.1 mol/L逐漸調(diào)至0.8 mol/L. 將溶液靜置3 min后測試吸收光譜. 通過oxTMB在652 nm處的吸收光譜變化監(jiān)測TMB的氧化過程. 利用米-門二氏方程式的雙倒數(shù)曲線

計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax[27].

1.6 羥基自由基檢測

將DMPO作為羥基自由基的捕獲劑進行電子自旋共振(ESR)光譜檢測， 將0.2 mL的Ag-CDs納米粒子、 0.01 mL的DMPO和0.02 mL過氧化氫(體積分?jǐn)?shù)為30%)混合. 靜置3 min后, 檢測羥基自由基的ESR譜. 分別將AgCDs納米粒子或過氧化氫與DMPO混合, 并檢測ESR光譜作為對照.

1.7 尿酸的協(xié)同檢測

將0.5 mL Ag-CDs納米粒子、 1 mL過氧化氫(4 mmol/L)和1 mL的TMB(4 mmol/L)混合， 20 min后檢測混合物的吸收光譜和SERS光譜. 先分別向混合溶液中加入不同濃度的尿酸溶液, 再將尿酸溶液替換為相同濃度的NaCl、 KCl、 草酸、 尿素和葡萄糖水溶液, 研究尿酸檢測的選擇性. 分別檢測各樣品的吸收光譜和SERS光譜.

2 結(jié)果與討論

CDs的TEM和高分辨TEM(HRTEM)照片如圖1所示. 由圖1可見, CDs尺寸均勻, 直徑約為2.5 nm, 具有良好的分散性. Ag-CDs納米粒子的TEM和HRTEM照片如圖2所示. 由圖2可見, Ag核的直徑為30 nm, 碳殼的厚度為2.2 nm. CDs的晶格間距為0.312 nm, Ag核的晶格間距為0.238 nm, 分別與石墨烯的(002)面和Ag的(111)面相對應(yīng), 表明Ag核的晶格結(jié)構(gòu)良好, CDs具有與石墨烯相似的晶格結(jié)構(gòu). CDs和Ag-CDs納米粒子的X射線衍射(XRD)譜如圖3所示. 由圖3可見, 位于28.6°處的峰來自CDs, 在38°,44°,64°和77°處的4個強峰分別對應(yīng)Ag核的(111)，(200)，(220)，(311)面, 表明Ag核結(jié)晶良好, 具有面心立方結(jié)構(gòu). CDs和Ag-CDs納米粒子的Fourier變換紅外(FTIR)光譜如圖4所示. 由圖4可見, CDs和Ag-CDs納米粒子具有多個明顯特征峰, 位于1 129,1 069 cm-1處的峰分別對應(yīng)C—O—C的反對稱和對稱伸縮振動[28], 位于839 cm-1處的峰對應(yīng)N—H的形變振動, 位于1 269,1 319 cm-1處的峰對應(yīng)C—O振動[29]. 此外, Ag-CDs納米粒子在1 389.7 cm-1處出現(xiàn)一個新的特征峰, 對應(yīng)C—N振動. 因此碳膜的形成是基于氨基和羧基之間的酰胺反應(yīng).

圖1 CDs的TEM和HRTEM照片F(xiàn)ig.1 TEM and HRTEM images of CDs

圖2 Ag-CDs納米粒子的TEM和HRTEM照片F(xiàn)ig.2 TEM and HRTEM images of Ag-CDs nanoparticles

圖3 CDs和Ag-CDs納米粒子的XRD譜Fig.3 XRD patterns of CDs and Ag-CDs nanoparticles

圖4 CDs和Ag-CDs納米粒子的FTIR光譜Fig.4 FTIR spectra of CDs and Ag-CDs nanoparticles

圖5 CDs和Ag-CDs納米粒子的XPSFig.5 XPS of CDs and Ag-CDs nanoparticles

圖6 Ag-CDs納米粒子中Ag 3d的精細能譜Fig.6 Fine energy spectra of Ag 3d of Ag-CDs nanoparticles

圖7 CDs和Ag-CDs納米粒子的紫外-可見吸收光譜Fig.7 UV-Vis absorption spectra of CDS and Ag-CDs nanoparticles

圖8 CDs和Ag-CDs納米粒子的發(fā)射光譜Fig.8 Emission spectra of CDs and Ag-CDs nanoparticles

Ag-CDs納米粒子具有良好的SERS活性, 可用作SERS基底. 圖9為探針分子4-ATP在不同基底上的SERS光譜. 由圖9可見, 在1 076,1 142,1 390,1 434,1 577 cm-1處的信號峰均來自探針分子4-ATP[30], Ag-CDs納米粒子比Ag納米粒子具有更好的SERS活性. Ag-CDs納米粒子增強的SERS活性是由于電磁場增強所致[31]. 圖10為用三維有效差分時域法模擬Ag-CDs納米粒子周圍的光電場. 由圖10可見, 在Ag核之間的納米縫隙處光電場明顯增強, 因此以Ag-CDs納米粒子為SERS基底的探針分子信號明顯增強.

圖9 不同基底4-ATP的SERS光譜Fig.9 SERS spectra of 4-ATP on different substrates

圖10 Ag-CDs納米粒子的光電場模擬Fig.10 Photoelectric field simulation of Ag-CDs nanoparticles

在過氧化物酶的催化作用下, TMB被過氧化氫氧化生成藍色溶液. 圖11為TMB氧化過程中吸收光譜隨時間的變化曲線, 其中插圖為在TMB溶液中加入Ag-CDs納米粒子(Ⅰ)，CDs(Ⅱ)，Ag納米粒子(Ⅲ)和空白組(Ⅳ)的樣品照片. 由圖11可見： 在Ag-CDs納米粒子的催化作用下, oxTMB在652 nm處的吸收峰強度增加最快, 溶液明顯變藍, 表明Ag-CDs納米粒子具有良好的類過氧化物酶催化活性； 當(dāng)以CDs為催化劑時, oxTMB吸收峰強度增加緩慢, 溶液輕微變藍; Ag納米粒子與空白對照組結(jié)果接近, 表明單獨的Ag納米粒子不具有催化活性. 通過穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析進一步研究Ag-CDs納米粒子的催化活性, 結(jié)果如圖12所示, 其中： (A)為固定過氧化氫濃度, 改變TMB濃度； (B)為固定TMB濃度, 改變過氧化氫濃度. 以TMB或過氧化氫為底物觀察米-門曲線. 動力學(xué)參數(shù)根據(jù)Lineweaver-Burk曲線計算. 以TMB和過氧化氫為底物的Km值分別為0.049,0.287，Vmax值分別為5.51×10-8,3.17×10-8m/s.

圖11 不同樣品中oxTMB在652 nm處 吸收光譜隨時間的變化Fig.11 Changes of absorption spectra of oxTMB at 652 nm in different samples with time

圖12 穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析Fig.12 Dynamic analysis of steady state

Ag-CDs納米粒子在催化過氧化氫氧化TMB過程中具有較低的Km和Vmax值, 表明Ag-CDs納米粒子對底物具有較好的親和性, 從而表現(xiàn)出良好的催化活性. 以DMPO為自由基捕獲劑, 不同樣品中羥基自由基的ESR光譜如圖13所示. 由圖13可見, DMPO與過氧化氫或Ag-CDs納米粒子的混合溶液未檢測到明顯的ESR信號. 當(dāng)DMPO與過氧化氫和Ag-CDs納米粒子混合時, 檢測到強度比為1∶2∶2∶1的4個等距信號, 信號來自捕獲了羥基自由基的DMPO. 表明過氧化氫在Ag-CDs納米粒子的催化下被分解為羥基自由基, TMB被羥基自由基氧化.

圖13 不同樣品中羥基自由基的ESR光譜Fig.13 ESR spectra of hydroxyl radicals in different samples

Ag-CDs納米粒子良好的類過氧化物酶活性與電子轉(zhuǎn)移增強有關(guān)[32]. CDs最低的空軌道(LUMO)高于Ag的Fermi能級. 在Ag-CDs納米粒子中, 電子可從碳殼的LUMO能級向Ag核的Fermi能級轉(zhuǎn)移. 界面上的電子進一步與過氧化氫結(jié)合, 并將過氧化氫分解為羥基自由基. 由于碳殼與Ag核間的相互作用, 因此Ag-CDs納米粒子具有良好的類過氧化物酶催化活性. 基于Ag-CDs納米粒子的催化性質(zhì)可將其用于尿酸檢測. Ag-CDs納米粒子可促進羥基自由基氧化TMB, 加入尿酸后, 藍色的oxTMB被還原為無色的TMB[33].

不同濃度尿酸的oxTMB紫外-可見吸收光譜和SERS光譜如圖14所示. 由圖14(A)可見: oxTMB的吸收峰隨尿酸濃度的增加而逐漸降低, 當(dāng)尿酸濃度為0.1 μmol/L時, oxTMB的吸收峰幾乎沒有變化; 當(dāng)尿酸濃度小于5 μmol/L時, 溶液顏色沒有明顯變化, 靈敏度較低. 由圖14(B)可見: 尿酸濃度的檢測范圍為0.01～500 μmol/L; 隨著尿酸濃度的增加, oxTMB的SERS信號逐漸降低, 當(dāng)尿酸濃度為0.01 μmol/L時, SERS信號強度仍變化明顯.

圖14 不同濃度尿酸的oxTMB紫外-可見吸收光譜(A)和SERS光譜(B)Fig.14 UV-Vis absorption spectra (A) and SERS spectra (B) of oxTMB with different concentrations of uric acid

oxTMB在1 605 cm-1處的SERS信號強度與尿酸濃度的關(guān)系如圖15所示. 由圖15可見: 當(dāng)尿酸濃度為0.01～100 μmol/L時, oxTMB在1 605 cm-1處信號峰強度隨尿酸濃度顯著變化; 當(dāng)尿酸濃度為1～25 μmol/L時, SERS信號強度隨尿酸濃度呈線性變化. 因此用SERS光譜檢測可提高檢測靈敏度. 為測試尿酸檢測的選擇性, 用其他干擾物質(zhì)代替尿酸檢測oxTMB的SERS信號變化, 結(jié)果如圖16所示, 其中干擾物質(zhì)包括在血液和尿液中含量較高的NaCl、 KCl、 葡萄糖、 草酸和尿酸. 由圖16可見, 干擾物質(zhì)未使SERS信號發(fā)生明顯變化, 表明用SERS光譜檢測尿酸具有良好的選擇性.

圖15 oxTMB在1 605 cm-1處的SERS 信號強度與尿酸濃度的關(guān)系Fig.15 Relationship between SERS signal intensity of oxTMB at 1 605 cm-1 and concentration of uric acid

圖16 在尿酸及其他物質(zhì)作用下oxTMB 的SERS信號強度變化Fig.16 Changes of SERS signal intensity of oxTMB under action of uric acid and other substances

綜上, 本文以CDs為還原劑制備了具有良好SERS活性和類過氧化物酶催化活性的核殼結(jié)構(gòu)Ag-CDs納米粒子. 采用三維有效差分時域法研究了Ag-CDs納米粒子的SERS增強機理, 并通過TMB的氧化實驗研究了Ag-CDs納米粒子的催化活性. 由于尿酸可將藍色的oxTMB還原為無色的TMB, 因此可用比色法協(xié)同SERS光譜檢測尿酸, 該協(xié)同檢測方法具有檢測限低、 檢測范圍廣和檢測精度高等優(yōu)點.