邵洋洋，陳勝男，林金森，鐘汝情，鄒育根，謝 瑩，李佳明，陳菲菲，張 杰，郭文娥

（廣州中科基因檢測(cè)服務(wù)有限公司，廣東 廣州 510000）

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患致病菌，可分為 A、B、C、D、E 型，在豬群中主要流行A、C型，A型主要產(chǎn)生α-毒素，產(chǎn)生腸毒血癥，導(dǎo)致中、大豬的突然死亡；C型主要產(chǎn)生α、β-毒素，是造成仔豬紅痢的主要病因。其普遍存在于人畜糞便、土壤、水、塵埃中，加之夏季高溫高濕氣候、雨水多等因素，加快了細(xì)菌、病毒繁殖擴(kuò)散和傳播速度，極易造成產(chǎn)氣莢膜梭菌等一些自然疫源性疫病的流行。產(chǎn)氣莢膜梭菌常與巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌混合感染，使病情更加嚴(yán)重。

1 發(fā)病情況與剖檢癥狀

2021年8月份，廣西某大型種豬場(chǎng)引進(jìn)后備種豬后，豬群出現(xiàn)精神沉郁、眼屎淚斑增多、群體腹瀉。隨后陸續(xù)出現(xiàn)呼吸急促，腹圍迅速膨大，有腹痛表現(xiàn)，臥地不起，伴有體溫升高等癥狀，并且不斷出現(xiàn)死亡豬只。剖檢可見血性的心包積液，腹腔臟器漿膜纖維蛋白滲出，全身性感染繼發(fā)肺部感染，導(dǎo)致肺部高度水腫、器官帶有泡沫性液體，血源性散播導(dǎo)致干泛區(qū)域至全肺可見小葉性病變，手觸有細(xì)小顆粒感，從細(xì)支氣管內(nèi)可擠出黏性、膿性分泌物，肝臟淤血腫大、肝出血，小腸出血、空腸及回腸嚴(yán)重鼓氣，腹股溝淺淋巴結(jié)腫大呈黑紫色、切面呈大理石樣，急性出血性淋巴結(jié)炎（見圖1）。

圖1 發(fā)病豬只病理解剖圖

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

2.1.1 觸片鏡檢

取干凈的載玻片，表面用點(diǎn)燃的酒精棉進(jìn)行擦拭消毒，無菌操作切出一小塊肺臟組織，再用新鮮切面進(jìn)行觸片，以酒精燈火焰固定，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。肺臟觸片經(jīng)革蘭氏染色可見優(yōu)勢(shì)菌，革蘭氏陽性粗壯桿菌、兩頭鈍圓、菌體大小為（0.9~1.3）×（3.0~9.0）μm、無鞭毛、未見芽孢；革蘭氏染色陰性菌、無芽孢、兩端鈍圓的短桿菌（見圖2）。

圖2 肺臟觸片鏡檢結(jié)果（H.E.染色10×）

2.1.2 分離培養(yǎng)

無菌操作用接種環(huán)在新鮮的肺臟和肝臟切面蘸取少量組織，在血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行過“Z”字形劃線，將上述培養(yǎng)基置于37℃恒溫需氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。重新切取新鮮組織，在加有1%的NAD血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

過夜需氧培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上有大量密集的白色呈中等大小的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌; 厭氧培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有中等大小有溶血環(huán)的菌落，鏡檢為粗短大桿菌，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列，偶見鏈狀的革蘭氏陽性桿菌（見圖3）。

圖3 肺臟觸片鏡檢結(jié)果（H.E.染色10×）

2.1.3 16 S rRNA測(cè)序及序列分析

挑取單個(gè)陰性菌落接種到普通肉湯中，置于培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)增菌；陽性菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的菌液，利用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA。Es Taq MasterMix聚合酶PCR反應(yīng)體系20 μL， 其中2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，細(xì)菌模板2 μL，加滅菌超純水4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸 20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，均擴(kuò)增出約1 428 bp的片段與目的條帶大小一致（見圖 4）；PCR產(chǎn)物送廣州擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。分別將2株分離菌的16S rRNA 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定革蘭氏陽性菌測(cè)序結(jié)果比對(duì)為產(chǎn)氣莢膜梭菌型D型，革蘭氏陰性菌測(cè)序結(jié)果比對(duì)為大腸桿菌。

圖4 16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌藥物敏感試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B）測(cè)定大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)豬場(chǎng)常用抗菌類藥物的敏感性。用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面。37℃培養(yǎng)16~24 h以后，測(cè)量各藥敏紙片抑菌圈直徑，結(jié)果見表1、表2。

表1 大腸桿菌藥物敏感試驗(yàn)

表2 產(chǎn)氣莢膜梭菌藥物敏感試驗(yàn)

2.3 常規(guī)病毒q-PCR檢測(cè)

無菌采集病死豬的肝臟、肺臟、淋巴結(jié)，加入5倍體積的PBS，組織研磨儀研磨后離心，取200 μL上清液，使用核酸自動(dòng)提取儀提取核酸，用世紀(jì)元亨商品化試劑盒檢測(cè)豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒。結(jié)果表明，病料中除豬圓環(huán)病毒2型，其他病原均為陰性。

3 防治措施

全群飼料添加地美硝唑20%2.5 kg/t、復(fù)方阿莫西林10% 2~3 kg/t以及恩諾沙星1 kg/t，另外可適當(dāng)添加保肝顆粒防止用藥時(shí)間長(zhǎng)對(duì)肝損傷嚴(yán)重。對(duì)于嚴(yán)重的個(gè)體病例，肌注板藍(lán)根注射液0.1~0.2 mL/kg用以中和內(nèi)毒素、頭孢噻肟注射液、恩諾沙星注射液；后續(xù)豬群逐漸穩(wěn)定，死亡率降低；但仍要做到加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好預(yù)防保健。不同棟舍人員嚴(yán)格隔離，專人專崗不能隨意串舍串崗；對(duì)發(fā)病的豬只做到及時(shí)隔離、及早治療，防止疾病的交叉?zhèn)鞑ィ涣硗鈱?duì)該豬群的免疫程序進(jìn)行核查，補(bǔ)打豬圓環(huán)病毒疫苗，同時(shí)做好豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病等常見病毒病疫苗的免疫，提高豬群整體免疫力；加強(qiáng)環(huán)境管理，對(duì)產(chǎn)房、豬舍、周圍環(huán)境做好消毒工作，控制好豬舍溫度、濕度，夏季保持通風(fēng)、冬季防止賊風(fēng)侵入。

4 討論

自從2020年7月飼料全面禁抗以來，全國(guó)豬場(chǎng)細(xì)菌性感染的病例逐漸增加，腸道有害病原菌得不到有效地控制，加之飼料高溫、水源酸化、消毒，以前從飼料和水源中能得到有益菌補(bǔ)充這一途徑被切斷，沒有了有益菌的平衡作用，有害菌過量繁殖以梭菌性疾病、大腸桿菌、沙門氏菌等全身性感染尤為常見，豬群腸道健康問題突出，導(dǎo)致育肥階段特別是保育階段的腹瀉率增加、成活率下降，最終生長(zhǎng)變緩、料重比增加，經(jīng)濟(jì)效益直接下降。加之后非洲豬瘟?xí)r代行情低迷，常規(guī)免疫程序未能完全執(zhí)行，導(dǎo)致豬群整體免疫力下降，因此在應(yīng)激或者免疫抑制性疾病（如豬圓環(huán)病 毒病等）存在情況下，很容易導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的全身感染，給臨床獸醫(yī)的診斷治療帶來困難。