肖明霞，王乙茹，柳成東，屈 娥，趙 平，程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州 635001）

飼用益生菌等安全添加劑的篩選與評估一直是飼料添加劑領(lǐng)域的重要方向之一，尤其是2020 年后我國飼料工業(yè)禁用了以促生長為目的的藥物類飼料添加劑。近年來，丁酸梭菌（）成為行業(yè)研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)之一，大量飼養(yǎng)試驗表明飼用丁酸梭菌通過顯著抑制畜禽腸道主要有害菌實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)性能的改善；也有報道稱丁酸梭菌未能顯著改善畜禽生長性能。以上矛盾的結(jié)論提示，丁酸梭菌飼用價值的動物試驗評估結(jié)果不穩(wěn)定，可能受試驗材料（丁酸梭菌菌株）、試驗設(shè)計、養(yǎng)殖動物、飼養(yǎng)條件等差異化條件的影響，且動物試驗所需的費(fèi)用高、周期長。所以，通過實(shí)驗室益生菌評估技術(shù)，能夠科學(xué)、高效的初篩益生性能突出的丁酸梭菌菌株，這有助于提高后續(xù)動物飼養(yǎng)試驗的可重復(fù)性和研發(fā)效率。

抑菌性能是飼用益生菌發(fā)揮益生性能的關(guān)鍵評估指標(biāo)，也是替代抗生素改善畜禽生產(chǎn)性能的重要機(jī)制之一。根據(jù)現(xiàn)有牛津杯法評估丁酸梭菌抑菌性能的報道，發(fā)現(xiàn)兩個問題：①未系統(tǒng)研究丁酸梭菌的抑菌作用。目前，報道丁酸梭菌對致病大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的文獻(xiàn)較多，但對腸道有益菌及其他商業(yè)飼用益生菌抑制作用研究的報道極少；②抑菌效果不明確。現(xiàn)有涉及丁酸梭菌抑菌性能評估的試驗報道中，未見以抗生素為對照組的實(shí)驗設(shè)計，這不利于比較確定丁酸梭菌的抑菌效果。隨著世界畜牧業(yè)“禁抗”的發(fā)展趨勢，丁酸梭菌等替抗飼用益生菌制劑的研發(fā)必須重視產(chǎn)品的抑菌作用及其效果。據(jù)此，本研究采用牛津杯法，設(shè)計土霉素為對照組，對比評估丁酸梭菌對畜禽腸道主要有害菌、腸道主要有益菌、飼料源有害菌、商業(yè)飼用益生菌的抑制作用及效果，為丁酸梭菌在養(yǎng)殖業(yè)的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 丁酸梭菌（）由課題組前期從云南地方品種豬“大河豬”的養(yǎng)殖場中分離獲得，經(jīng)16sRNA 鑒定命名為丁酸梭菌YNAU 3318，用于本次抑菌性能評估。土霉素購買于葉源生物有限公司。土霉素抑菌濃度400 mg/L，參考課題組前期報道。

1.2 試驗設(shè)計 為全面評估畜禽飼用丁酸梭菌的抑菌性能，包括其對有害菌（腸道主要有害菌、飼料源有害菌）的拮抗效應(yīng)，以及對有益菌（腸道主要有益菌、其他商業(yè)飼用益生菌）可能的拮抗效應(yīng)，本研究設(shè)3 個處理組，即陽性對照組（土霉素組）、陰性對照組（無菌蒸餾水組）、丁酸梭菌組，采用牛津杯法評估丁酸梭菌對4 類14 個指示菌的抑制效果，4 類指示菌的選擇依據(jù)實(shí)際畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)問題及復(fù)合益生菌產(chǎn)品研發(fā)的需求進(jìn)行創(chuàng)新研究，見表1。指示菌購于北京百歐博偉生物科技有限公司和北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

表1 14 個指示菌的分類及菌株編號

1.3 牛津杯抑菌試驗步驟及抑菌作用判定

1.3.1 丁酸梭菌及指示菌的培養(yǎng) 丁酸梭菌采用RCM培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h。指示菌大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等采用LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。產(chǎn)氣莢膜梭菌采用血瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h；指示菌羅伊氏乳酸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、凝結(jié)芽孢桿菌等采用MRS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。嗜熱雙歧桿菌采用BBL 培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)48 h。以上指示菌的培養(yǎng)基，其成分及培養(yǎng)條件參照課題組前期報道。

1.3.2 制備指示菌涂布平板 平板涂布采用MRS培養(yǎng)基，配制好后將其放置121℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min，在每個培養(yǎng)皿倒入15～20 mL MRS 培養(yǎng)基，凝固后涂布。

1.3.3 牛津杯抑菌操作 吸取經(jīng)培養(yǎng)24 h 或48 h 的指示菌菌液800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，將指示菌濃度稀釋10涂布。為比較土霉素、無菌蒸餾水、丁酸梭菌對某一個指示菌的抑制作用，取200 μL指示菌稀釋液涂布，放置3 個牛津杯在培養(yǎng)皿中，各注入土霉素、無菌蒸餾水、丁酸梭菌菌液200 μL。培養(yǎng)皿置于恒溫箱37.5℃培養(yǎng)，除指示菌凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱雙歧桿菌培養(yǎng)48 h 外，其他12 個指示菌培養(yǎng)24 h。以上操作每個指示菌做3 個重復(fù)，并平行測定3 次。抑菌圈直徑（Diameter Of Inhibition Zone，DIZ）用游標(biāo)卡尺測量。

1.3.4 抑菌作用判定 以DIZ 的最大值和最小值的平均值確定DIZ，并判定抑菌作用。由于丁酸梭菌抑菌作用沒有統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)實(shí)測DIZ 數(shù)據(jù)范圍，并參考謝麗靜等和羅璠等報道，抑菌作用的判定標(biāo)準(zhǔn)為：“不敏感”：DIZ=7.8 mm；“低敏感”：7.8 mm12.0 mm。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SAS9.2 統(tǒng)計軟件對抑菌圈直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用 由表2 和圖1 可知，丁酸梭菌對大腸桿菌K88、豬霍亂沙門氏桿菌的抑菌作用達(dá)“高敏感”（DIZ>12.0 mm），對大腸桿菌K99、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用為“中敏感”（10 mm

圖1 丁酸梭菌對腸道主要有害菌的抑制作用

表2 丁酸梭菌與無菌蒸餾水、土霉素對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用 mm

2.2 丁酸梭菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制作用 由表3 及圖2 可知，丁酸梭菌對腸道有益菌（羅伊氏乳酸桿菌和嗜熱雙歧桿菌）的抑制作用“不敏感”。土霉素“高敏感”抑制羅伊氏乳酸桿菌，但對嗜熱雙歧桿菌“不敏感”。此外，無菌蒸餾水對羅伊氏乳桿菌、嗜熱雙歧桿的抑菌作用均為“不敏感”。

圖2 丁酸梭菌對腸道主要有益菌羅伊氏乳酸桿菌（A）、嗜熱雙歧桿菌（B）的抑制作用

表3 丁酸梭菌與無菌蒸餾水、土霉素對畜禽腸道主要有益菌的抑制作用 mm

2.3 丁酸梭菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 由圖3 可知，丁酸梭菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用達(dá)“高敏感”（DIZ=13.0 mm），但抑制效果低于（<0.001）土霉素（DIZ=28.4 mm）。此外，無菌蒸餾水對金黃色葡萄球菌無抑制作用，抑菌作用判定“不敏感”。

圖3 丁酸梭菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 丁酸梭菌對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 由表4 和圖4 可知，丁酸梭菌對凝結(jié)芽孢桿菌的抑制作用達(dá)“高敏感”，對地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”，對枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，對屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用判定為“不敏感”。土霉素對凝結(jié)芽孢桿菌、屎腸球菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用達(dá)“高敏感”，且抑制效果大于丁酸梭菌（<0.001）；土霉素對糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用判定為“不敏感”。此外，無菌蒸餾水對以上6 個指示菌的抑制作用均判定為“不敏感”。

表4 丁酸梭菌與無菌蒸餾水、土霉素對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 mm

圖4 丁酸梭菌對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用

3 討論

3.1 丁酸梭菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用 致病大腸桿菌、沙門氏菌是畜禽腸道常見致病菌，感染畜禽出現(xiàn)腹瀉、下痢等癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。本研究顯示，丁酸梭菌對大腸桿菌K88、豬霍亂沙門氏菌的抑制作用為“高敏感”，對大腸桿菌K99 的抑制作用為“中敏感”，表明丁酸梭菌對畜禽腸道主要有害菌有較好的抑制作用。謝麗靜等采用牛津杯法判定丁酸梭菌對大腸桿菌的抑制作用為“高敏感”；賈麗楠等研究顯示丁酸梭菌對大腸桿菌的抑制作用為“中敏感”；肖海蒂評估了3 株丁酸梭菌（菌株編號D-2、D-8、D-19）對大腸桿菌的抑制作用，其中2 株達(dá)“高敏感”、1 株為“中敏感”。此外，王倩等研究結(jié)果顯示丁酸梭菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用為“高敏感”。以上報道與本研究結(jié)果基本一致。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是引發(fā)家禽壞死性腸炎的致病菌，感染家禽死亡率高，嚴(yán)重危害家禽生產(chǎn)性能。僅有的2 篇體外抑菌試驗報道顯示，丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用為“低敏感”和“不敏感”。本研究首次發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用為“中敏感”，提示不同菌株的丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用有顯著差異。Yang 等和Abdel-Latif 等研究顯示，與對照組比，飼糧添加丁酸梭菌顯著降低肉雞腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，從而改善了生長性能。Zhang等進(jìn)一步用攻毒試驗?zāi)Ｐ妥C明，飼用丁酸梭菌顯著降低感染肉雞的腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量，平衡腸道菌群。本次體外評估丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌作用的結(jié)果與上述報道的飼用丁酸梭菌能抑制腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)論相符。

丁酸梭菌對5 個畜禽腸道主要有害菌的抑制效果整體弱于土霉素。Han 等報道，與抗生素組相比，丁酸梭菌組斷奶仔豬的糞便成形度評分顯著較差。Han 等研究顯示，丁酸梭菌組肉雞1～21 日齡的耗料增重比顯著高于抗生素組。Zhang 等采用大腸桿菌攻毒肉雞試驗證明，28 日齡采食丁酸梭菌飼糧組肉雞體重比采食抗生素飼糧組肉雞體重低約6.0%。以上比較飼用丁酸梭菌與抗生素對豬雞生長性能影響的結(jié)果，與本次體外抑菌試驗結(jié)果相符。

3.2 丁酸梭菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制作用 乳酸桿菌和雙歧桿菌是畜禽腸道的常在優(yōu)勢菌群，鑒于土霉素等廣譜抗生素對腸道有益菌的拮抗效應(yīng)，評估丁酸梭菌對腸道主要有益菌可能的抑菌作用十分必要。本研究顯示，丁酸梭菌對羅伊氏乳桿菌、嗜熱雙歧桿菌無抑制，這與朱曉慧等報道一致。另外，土霉素對羅伊氏乳桿菌的抑制達(dá)“高敏感”。以上結(jié)果提示，與抗生素相比，丁酸梭菌與腸道主要有益菌無拮抗效應(yīng)，丁酸梭菌維持畜禽腸道菌群平衡的效果優(yōu)于抗生素。動物試驗也顯示，飼用丁酸梭菌不同程度地增加了畜禽腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，這對改善畜禽生產(chǎn)性能有積極作用。

3.3 丁酸梭菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料重點(diǎn)監(jiān)測的有害菌之一，畜禽攝入金黃色葡萄球菌污染的飼料及飼料原料，危害畜禽健康。由于土霉素等廣譜飼用抗生素能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌，但當(dāng)前“禁抗”形式下須重新審視這一實(shí)際生產(chǎn)問題。本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用達(dá)“高敏感”，與前人的報道基本一致，表明飼糧添加丁酸梭菌具有預(yù)防畜禽感染飼料源金黃色葡萄球菌的作用。誠然，丁酸梭菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果顯著低于土霉素。

3.4 丁酸梭菌對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 我國《飼料添加劑品種目錄》（2013）收錄了34 種飼用益生菌，當(dāng)前推廣應(yīng)用較多的包括丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌及凝結(jié)芽孢桿菌。本研究重點(diǎn)評估了丁酸梭菌對以上6 個主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用，結(jié)果顯示丁酸梭菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，對糞腸球菌、屎腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用均為“不敏感”。僅有的1 篇體外抑菌試驗顯示，丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌、糞腸球菌無拮抗效應(yīng)，該報道建議丁酸梭菌可以與枯草芽孢桿菌、糞腸球菌組合應(yīng)用。Abdel-Latif 等通過飼養(yǎng)試驗評估飼用丁酸梭菌、酵母菌單一及組合應(yīng)用對肉雞生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果顯示與單一添加丁酸梭菌組比，組合使用丁酸梭菌和酵母菌的肉雞死亡率顯著降低、盲腸有益菌乳酸桿菌顯著增加。Abdel-Latif 等建議推廣丁酸梭菌與酵母菌的復(fù)合飼用益生菌產(chǎn)品。

本研究首次通過體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌對凝結(jié)芽孢桿菌的抑制作用達(dá)“高敏感”，這提示丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌之間存在拮抗效應(yīng)。樊英等評估了丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌單一及組合應(yīng)用對虹鱒魚生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果顯示與基礎(chǔ)飼糧的對照組比，單一應(yīng)用丁酸梭菌或單一應(yīng)用凝結(jié)芽孢桿菌均能顯著提高虹鱒魚腸道優(yōu)勢有益菌比例，改善生長性能；然而，與單一的丁酸梭菌組、凝結(jié)芽孢桿菌組比，組合應(yīng)用丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌組的虹鱒魚腸道優(yōu)勢有益菌比例沒有進(jìn)一步提升、生長性能也未能明顯改善，結(jié)果表明飼糧單一添加丁酸梭菌或凝結(jié)芽孢桿菌有利于虹鱒魚養(yǎng)殖生產(chǎn)，但二者組合使用未能進(jìn)一步提高生產(chǎn)性能。以上結(jié)果驗證了本研究丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌之間的拮抗效應(yīng)。

丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母沒有拮抗效應(yīng)。然而，丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌之間存在拮抗效應(yīng)，建議畜禽飼料中的組合應(yīng)用需謹(jǐn)慎考慮。

4 結(jié)論

本研究采用牛津杯法首次較為系統(tǒng)地評估了丁酸梭菌的抑菌性能，為飼糧添加丁酸梭菌平衡畜禽腸道菌群及促生長的作用效果提供了科學(xué)依據(jù)。此外，建議商業(yè)復(fù)合飼用益生菌應(yīng)充分考慮丁酸梭菌與其他益生菌之間可能的拮抗效應(yīng)。