付鵬程 韋秋前 史明艷

（洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，洛陽 471934）

青藏高原地區(qū)是全球生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一，是研究植物遺傳分化與適應(yīng)性進(jìn)化的熱點(diǎn)地區(qū)。大量的生物地理學(xué)研究和譜系地理學(xué)研究均表明，青藏高原地區(qū)植物遺傳分化受到了造山運(yùn)動(dòng)和冰川運(yùn)動(dòng)引發(fā)的環(huán)境與氣候變化的深刻影響。然而，不同物種對(duì)環(huán)境與氣候變化的響應(yīng)模式存在較大的差異，例如植物具有多種不同類型的冰期避難所與擴(kuò)張模式，高山植物對(duì)全球氣候變化的響應(yīng)也與低海拔植物存在顯著不同。因此，進(jìn)一步探討青藏高原地區(qū)植物的遺傳分化及其對(duì)過去環(huán)境與氣候變化的響應(yīng)模式，可以為更好地理解全球氣候變化背景下的植物進(jìn)化與多樣性形成機(jī)制提供參考。

龍膽屬（）以青藏高原及其周邊地區(qū)為分布中心和分化中心，是我國植物多樣性的重要組成部分，很多物種具有很高的藥用和觀賞價(jià)值。岷縣龍膽（var.（Mar?quand）T. N. Ho）是龍膽屬高山組中的常見物種，多年生草本，是青藏高原特有植物。岷縣龍膽不僅是高山灌叢和草甸的重要組成部分之一，還具有較高的藥用價(jià)值，可用于藏藥。岷縣龍膽在《》中被處理為一個(gè)獨(dú)立的種（Marquand）；但在隨后出版的龍膽屬專著中作為一個(gè)變種，僅分布在青海、西藏、四川和甘肅四省，其原變種（var.）則廣布?xì)W洲、美洲和亞洲的部分高山地區(qū)。雖然物種龍膽屬已開展大量的進(jìn)化研究，但目前的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、葉綠體基因組進(jìn)化和遺傳分化等研究中均未包含岷縣龍膽，其遺傳分化歷史及其與青藏高原地質(zhì)與氣候變化的影響模式有待研究。

本研究以青藏高原地區(qū)的15個(gè)岷縣龍膽種群為研究對(duì)象，通過母系遺傳和雙親遺傳的分子標(biāo)記探討岷縣龍膽的遺傳分化和種群動(dòng)態(tài)歷史，研究結(jié)果將為龍膽屬以及其他高山植物的進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1樣品采集

在青藏高原地區(qū)采集15 個(gè)岷縣龍膽種群共119個(gè)個(gè)體，這些種群覆蓋了岷縣龍膽在中國現(xiàn)今的所有分布范圍。在種群內(nèi)采樣時(shí)，每個(gè)個(gè)體間距至少10 m。選取幼嫩的葉子用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20 ℃中。憑證標(biāo)本存于洛陽師范學(xué)院標(biāo)本館。詳細(xì)的采樣信息見表1。

表1 本研究中岷縣龍膽的樣品信息與遺傳多樣性指數(shù)Table 1 Sample information and genetic diversity index of G.algida var.purdomii in this study

1.2 DNA 提取與PCR擴(kuò)增

用CTAB 法提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電 泳 檢 測(cè)。選 用ITS1a/ITS4 引 物和 葉 綠 體rpl32-L 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增反應(yīng)參 見Taberlet 等。將PCR 產(chǎn)物純化后用ABI 3730xl（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行測(cè)序。

1.3遺傳分化與種群動(dòng)態(tài)分析

使用軟件Geneious Pro 3.5.6查看測(cè)序結(jié)果，并進(jìn)行序列比對(duì)。在軟件DnaSP 5.1中統(tǒng)計(jì)單倍型個(gè)數(shù)，對(duì)于有雜合位點(diǎn)的ITS 序列，用PHASE按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行基因分型。在Arlequin 3.5中計(jì)算基因多態(tài)性（）與核苷酸多態(tài)性（），并通過分子變異分析（AMOVA）檢測(cè)遺傳變異在居群內(nèi)和居群間的分布情況。用PERMUT計(jì)算居群遺傳分化系數(shù)和，并對(duì)算得的和做1 000次重復(fù)的置換檢驗(yàn)，以檢測(cè)單倍型的分布是否具有顯著的地理結(jié)構(gòu)。在Arlequin 3.5進(jìn)行歧點(diǎn)分布（mismatch distribution）分析和中性檢測(cè)分析，計(jì)算Fu’s和Tajima’s值。

采用最大似然法，在IQ-TREE中基于單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，核苷酸替換模型由IQ-TREE自動(dòng)計(jì)算，設(shè)置bootstrap 為1 000。用最大簡(jiǎn)約法在軟件Network 4.6中構(gòu)建單倍型的中央網(wǎng)絡(luò)連接圖。

基于貝葉斯馬爾科夫鏈蒙特卡洛鏈方法（Bayesian MCMC），用軟件BEAST 1.7.5估算岷縣龍膽各支系的分化時(shí)間。選用Yule process、嚴(yán)格分子鐘模型進(jìn)行計(jì)算。由于龍膽屬已發(fā)現(xiàn)的化石非常少，加之本研究中未包含龍膽屬全部主要類群，因此采用2 種方法對(duì)分化時(shí)間估算進(jìn)行校正。首先，選用龍膽屬僅有的秦艽（）化石來標(biāo)定外類群的共同祖先時(shí)間；其次，依據(jù)Favre等的結(jié)果，約束龍膽屬冠群時(shí)間的中位數(shù)為29.76 個(gè)百萬年。分析時(shí)做3 次獨(dú)立運(yùn)算，每次運(yùn)算10 000 000 代，每隔1 000 代取一棵樹，去掉前20%的預(yù)熱樹（Burn-in）。用Tracer 1.5（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/）查看有效采樣規(guī)模（effective sample size，ESS），保證所有指

標(biāo)均大于200。采用TreeAnnotator 1.7.5基于有效樹產(chǎn)生1棵分支分化時(shí)間樹。

1.4物種分布模型

從GBIF（Global Biodiversity Information Facili?ty）中下載岷縣龍膽的分布記錄，去掉引種馴化產(chǎn)生的記錄點(diǎn)，結(jié)合本研究記錄的物種分布記錄，在ArcGIS 10.2 中移除間距小于10 km 的分布點(diǎn)。從WorldClim 下載目前、中全新世（mid-Holocene，約6 kya）、末次盛冰期（LGM，約22 kya）和末次間冰期（LIG，約120～140 kya）的19 個(gè)生物氣候因子。為了避免多重共線性的影響，在SPSS 2.0 中計(jì)算生物氣候因子間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，去掉皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著大于0.9 的生物氣候因子。用軟件MaxEnt 3.4.1預(yù)測(cè)岷縣龍膽在不同時(shí)期的物種分布范圍。將75%分布數(shù)據(jù)用作訓(xùn)練集，余下的25%用作測(cè)試集，用AUC值對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)

葉綠體分子標(biāo)記在岷縣龍膽中共有11處堿基替換和6 處缺失/插入，共鑒定11 種單倍型（cP1-cP11）。大多數(shù)種群固定了1 種以上的單倍型（見表1，圖1）。核分子標(biāo)記在岷縣龍膽中共有14 處堿基替換和1 處缺失/插入，共鑒定25 種基因型（P1～P25），其中大部分為單個(gè)種群所獨(dú)有（見表1，圖1）?；谌~綠體數(shù)據(jù)計(jì)算得到的和分別是0.705 和0.512（>0.05），基于核基因數(shù)據(jù)算得的和分別是0.036 和0.023（>0.05）。葉綠體數(shù)據(jù)的分子變異分析的結(jié)果表明，發(fā)生在種群內(nèi)的遺傳變異（54.84%）略高于發(fā)在在種群間的變異（45.16%）；ITS 數(shù)據(jù)表明，發(fā)生在種群內(nèi)的遺傳變異占比高達(dá)97.73%（見表2）。基于葉綠體數(shù)據(jù)和ITS數(shù)據(jù)的分別為0.452和0.022。

表2 岷縣龍膽種群分子變異分析Table 2 AMOVA result of G.algida var.purdomii

圖1 岷縣龍膽單倍型/基因型的地理分布式樣PG.私有基因型；餅圖為不同采樣點(diǎn)中各單倍型的頻率（地圖來自星球研究所）Fig.1 Geographical distribution and phylogenetic relationship of 20 chloroplast haplotypes identified in G. algida var.purdomii.PG.Private genotypes；Pie charts display haplotype frequencies in each locality（the map is from Institute of Planet）

葉綠體數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，單倍型cP11 位于系統(tǒng)樹基礎(chǔ)，與其他類群的分化時(shí)間為3.71個(gè)百萬年（95%置信區(qū)間：1.92～5.75個(gè)百萬年），單倍型cP1 和cP2 與姊妹類群的分化時(shí)間為2.68 個(gè)百萬年（95%置信區(qū)間：1.32～4.05 個(gè)百萬年）（見圖2B）。中央網(wǎng)絡(luò)連接圖表明單倍型cP2位于網(wǎng)絡(luò)中央（見圖2A）。

圖2 基于葉綠體數(shù)據(jù)的岷縣龍膽單倍型中央網(wǎng)絡(luò)連接圖（A）與分化時(shí)間（B）A.餅圖大小表示單倍型數(shù)量；B.枝上數(shù)值表示貝葉斯后驗(yàn)概率；主要節(jié)點(diǎn)的分化時(shí)間用箭頭表示，灰條表示95%的置信區(qū)間Fig.2 Results of divergence time and median-joining network among chloroplast haplotypes in G.algida var.purdomiiA.Pie charts display number of each haplotype；B.Numbers on the branches indicate Bayesian posterior probabilities；Node age estimates are marked with black arrows，grey bars represent 95%highest posterior densities.

2.2種群動(dòng)態(tài)歷史與物種歷史分布范圍

基于葉綠體和ITS數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，岷縣龍膽的歧點(diǎn)分布均為單峰曲線（見圖3），說明種群大小近期發(fā)生過擴(kuò)張?；谌~綠體數(shù)據(jù)的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)u’s為1.339（=0.722），Tajima’s為-0.543（=0.312）；ITS 數(shù)據(jù)顯示Fu’s為-10.401（=0.007），Tajima’s為-0.131（=0.504）。

圖3 岷縣龍膽歧點(diǎn)分布分析曲線A.葉綠體數(shù)據(jù)；B.核基因數(shù)據(jù)Fig.3 Result of mismatch distribution analysis of G.algida var.purdomiiA.cpDNA dada；B.nrITS data

通過泊松相關(guān)性分析，保留了9個(gè)生物氣候因子（bio1-bio4，bio7，bio12-bio15）用于岷縣龍膽的歷史分布區(qū)重建。結(jié)果表明，岷縣龍膽從末次間冰期到現(xiàn)在的歷史分布范圍總體比較穩(wěn)定，末次盛冰期在阿里地區(qū)和喜馬拉雅地區(qū)有明顯收縮，末次盛冰期后經(jīng)過小幅擴(kuò)張形成現(xiàn)今的分布范圍（見圖4）。

圖4 基于物種分布模型模擬岷縣龍膽現(xiàn)在（A）、末次盛冰期（B）、中全新世（C）和末次間冰期（D）的潛在適宜分布區(qū)Fig.4 Result of species distribution model in G.algida var.purdomii（A.current；B.Last glacial maximum（LGM）；C.Mid holecene；LIG.Last interglacial）

3 討論

本研究表明，岷縣龍膽近期經(jīng)歷了種內(nèi)遺傳分化，遺傳多樣性較高。岷縣龍膽的在葉綠體數(shù)據(jù)中為0.452，高于龍膽屬高山組其他物種，如阿 墩 子 龍 膽（W. W. Smith，=0.232，AFLP 數(shù)據(jù)）和多花龍膽（T. N.Ho，=0.226，AFLP 數(shù)據(jù)）），也高于龍膽屬其他多年生植物如何氏秦艽（P. C. Fu & S. L.Chen，=0.185，葉綠 體 數(shù) 據(jù)；=0.423，ITS 數(shù)據(jù)）。在岷縣龍膽的分布范圍內(nèi)，由于沒有一個(gè)地區(qū)的遺傳多樣性和特有單倍型明顯高于其他地區(qū)，因而無法確定一個(gè)冰期避難所，這與高山植物綿參（Benth.）、石礫唐松草等（Lecoy.）相似?？紤]到岷縣龍膽分布地區(qū)內(nèi)山脈眾多，岷縣龍膽在冰期可能存在多個(gè)微型避難所，如高山植物西川紅景天（（Frod.）S.H.Fu）等。種群進(jìn)化歷史分析結(jié)果表明岷縣龍膽種群大小發(fā)生了近期擴(kuò)張，與之相一致，物種分布模型的結(jié)果也表明末次盛冰期以來岷縣龍膽的分布范圍有小幅擴(kuò)張。然而，岷縣龍膽在末次間冰期時(shí)在阿里地區(qū)有大量潛在適生區(qū)，但隨后發(fā)生明顯的收縮；而阿里地區(qū)現(xiàn)今氣候干燥，岷縣龍膽在這些地區(qū)沒有分布記錄。這些結(jié)果均表明岷縣龍膽的遺傳分化和種群動(dòng)態(tài)均受到了氣候變化的顯著影響。

以下兩個(gè)因素可能促進(jìn)了岷縣龍膽的種內(nèi)遺傳分化。第一，第四紀(jì)的氣候波動(dòng)。分化時(shí)間估算結(jié)果表明，岷縣龍膽種內(nèi)的遺傳分化主要發(fā)生在上新世晚期和更新世，此時(shí)青藏高原整體隆升已基本結(jié)束，冰川作用盛行，氣候波動(dòng)大。青藏高原地區(qū)眾多植物類群的遺傳分化均受到了第四紀(jì)氣候波動(dòng)的顯著影響。第二，高山峽谷地貌的地理隔離作用。岷縣龍膽分布的地區(qū)多為山脈峽谷地貌，易于形成片段化的生境，尤其是高山植物在應(yīng)對(duì)環(huán)境與氣候變化過程中會(huì)形成天空島效應(yīng)（sky island），起到了降低居群間基因流的作用，從而促進(jìn)了種內(nèi)的遺傳分化的積累。已有研究表明，青藏高原地區(qū)植物種內(nèi)的遺傳分化程度普遍較高，如星葉草（Max?im.）不同支系間的達(dá)到了0.89。

基于核基因數(shù)據(jù)，本研究在岷縣龍膽中檢測(cè)到了很高的遺傳多樣性，但其遺傳分化程度很低。ITS 序列在岷縣龍膽中的雜合度較高，通過基因分型，共檢測(cè)到25種基因型，但種群間共享的單倍型僅有P2 一種，僅為0.022。但基于葉綠體數(shù)據(jù)的分析表明，岷縣龍膽種內(nèi)的遺傳分化程度較高。比較分析兩套不同遺傳方式的數(shù)據(jù)，推測(cè)岷縣龍膽中ITS數(shù)據(jù)體現(xiàn)的低遺傳分化可能有兩個(gè)原因。第一，種內(nèi)基因交流頻繁。岷縣龍膽的花朵大，長3.0～4.5 cm，筒狀鐘形或漏斗形，筆者野外考察中發(fā)現(xiàn)熊蜂是其傳粉者之一，因此種內(nèi)可能存在較強(qiáng)的花粉流；加之岷縣龍膽種子細(xì)小，可借風(fēng)力傳播，可能存在一定的種子流。第二，ITS 序列的分辨率不足。ITS 序列是系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建的常用分子標(biāo)記之一，但常常無法區(qū)分近緣物種。在龍膽屬中，ITS 序列能很好的區(qū)分不同的組，但在種水平的分辨率一般，尤其是經(jīng)歷了快速的類群如小龍膽組等。龍膽屬高山組和多枝組的物種分化研究表明，即便是在形態(tài)和遺傳上均可以被區(qū)分的物種對(duì)，種間的遺傳分化程度不高，種內(nèi)的遺傳分化程度更低，因此低分辨率的分子標(biāo)記不足以檢測(cè)到種內(nèi)的遺傳分化。