張 陽 馬子蘭 徐珊珊 蘇 旭* 李梅英

（1. 上?？萍拣^自然史研究中心，上海 200041；2. 上海市靜安區(qū)科學(xué)技術(shù)協(xié)會，上海 200040；3. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008）

譜系地理學(xué)（Phylogeography）主要利用分子標(biāo)記探討物種的分布格局和進(jìn)化歷史與地質(zhì)事件之間的相互關(guān)系，進(jìn)一步推測物種現(xiàn)代分布格局的歷史成因。全球氣候變化尤其是第四紀(jì)冰期和間冰期氣候波動，導(dǎo)致反復(fù)而劇烈的環(huán)境變化，這些變化影響著全球動植物的地理分布和遺傳結(jié)構(gòu)。青藏高原（Qinghai-Tibet Plateau）被譽(yù)為“世界屋脊”和“地球第三極”，其復(fù)雜的地質(zhì)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生境特征，使該地區(qū)成為響應(yīng)全球氣候與環(huán)境變化最強(qiáng)烈的地區(qū)。近年來，諸多學(xué)者通過對青藏高原及毗鄰地區(qū)多種高山植物譜系地理學(xué)的研究，揭示了高山植物響應(yīng)第四紀(jì)冰期氣候波動的分布格局和進(jìn)化歷史，認(rèn)為它們主要存在兩種“避難”模式：一種模式是某些高山植物冰期或間冰期高原臺面上存在多個相互隔離的微型避難所，冰期后向周邊擴(kuò)散，這類植物有西藏沙棘（）、西川紅景天（）、露蕊烏頭（）等；另一種模式認(rèn)為青海云杉（）、長花馬先蒿（）、條紋狹蕊龍膽（）等高山植物冰期或間冰期從高原臺面退縮至邊緣避難所，冰期后重新擴(kuò)散至高原臺面。

研究表明，被子植物的葉綠體DNA 為母系遺傳，具有基因不重組、引物通用、進(jìn)化速率較慢等優(yōu)點，目前已成為植物譜系地理學(xué)研究的最佳分子標(biāo)記，尤其適用于單個物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和進(jìn)化歷史研究。黃纓菊（C.Winkl.）是青藏高原地區(qū)一種特有的高寒草甸藥用植物，隸屬于菊科（Asteraceae）、黃纓菊屬（），適生于海拔2 230～4 150 m的草甸、草原及干燥山坡，主要分布在中國青海、西藏、甘肅東南部、四川及云南西北部等地。黃纓菊具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、抗鹽堿等特性，對維持青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用；同時，該物種全草入藥，對吐血、子宮出血、十二指腸潰瘍出血、胃潰瘍及過敏性紫癜等療效明顯，有較高的藥用價值。迄今為止，有關(guān)黃纓菊的研究主要集中于化學(xué)成分、抗逆生理特性和分子系統(tǒng)學(xué)方面。譬如，Wang等和Barres等基于核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nrITS）和葉綠體基因（cpDNA）分別對黃纓菊屬及其近緣屬的系統(tǒng)親緣關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黃纓菊屬與蝟菊屬（）、肋果薊屬（）和山牛蒡?qū)伲ǎ┑染哂休^近的親緣關(guān)系，而與飛廉屬（）的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。然而，關(guān)于黃纓菊譜系地理學(xué)的的研究鮮見報道。據(jù)此，本研究利用、-和-3 個cpDNA 片段對黃纓菊進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，揭示黃纓菊的群體遺傳結(jié)構(gòu)、現(xiàn)代地理分布格局以及冰期時的避難所，旨在為今后黃纓菊物種形成機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

在青海東部和甘肅北部，共收集到黃纓菊20個居群、123 個個體（見表1 和圖1）。按照群體遺傳學(xué)采樣方法對黃纓菊進(jìn)行野外調(diào)查和采樣，即居群之間直線距離至少20 km，每個居群隨機(jī)采集3～13 個個體，個體之間間隔20 m 以上。野外采集生長良好且健康的黃纓菊新鮮嫩葉，迅速用硅膠干燥帶回實驗室，并記錄各居群的經(jīng)緯度、海拔、生境、伴生種等信息。憑證標(biāo)本存放于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）。

圖1 黃纓菊居群采樣圖及cpDNA單倍型分布餅狀圖大小代表每個居群單倍型的頻率（審圖號：GS（2019）1837號）Fig.1 The sampled location of all populations and distribution of cpDNA haplotypes of each population in X.subacaulisThe size of pie charts represents the frequency of haplotypes in each population（Map number：GS（2019）1837）

表1 黃纓菊cpDNA片段6種單倍型序列的變異位點Table 1 Variable sites of six haplotype sequences base on cpDNA fragments in X.subacaulis

1.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN）提取硅膠干燥的葉片總DNA。利用-、和-3 個cpDNA 片段 對黃 纓菊 所有個體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為25.00 μL，包含17.25 μL 的HO、2.50 μL 的10×PCR buf?fer（1.5 mmol·LMg）、2.00 μL 的dNTPs 混 合 液（10 mmol·L）、正反引物各1.00 μL（5 μmol·L）、0.25 μL 的DNA 聚合酶（5 U·μL）、DNA 模板1.00 μL（約100 ng）；反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55～59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36 次；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用MEGA 6.0 軟件對黃纓菊所有測序個體的序列進(jìn)行比對和手工校正，然后將cpDNA 的3 個片段（-、和-）串聯(lián)。采用DnaSP 5.0 軟件統(tǒng)計黃纓菊單倍型數(shù)目和變異位點；應(yīng)用PERMUT 2.0軟件計算總的遺傳多樣性（）、居群內(nèi)平均遺傳多樣性（），以及居群遺傳分化系數(shù)和，對和值進(jìn)行1 000 次重復(fù)置換檢驗；運(yùn)用ARLEQUIN 3.5 軟件計算每個居群的遺傳多樣性（）、核苷酸多樣性（）及單倍型組成和頻率，并利用分子變異（AMOVA）分析方法檢測黃纓菊居群內(nèi)和居群間的遺傳變異水平及分化系數(shù)（），同時依據(jù)公式=（1-）/2計算物種水平上居群間平均基因流；利用Ge?nAlEx 6.5中的Mantel 統(tǒng)計學(xué)檢驗比較黃纓菊居群平均遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性。

以葵花大薊（）為外類群，利用NETWORK 10.2軟件中的Median-joining 算法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖；采用PhyloSuite v1.2.2軟件，選用最佳模型F81，利用最大似然法（Maximum likeli?hood，ML）和貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建黃纓菊單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。ML 樹利用啟發(fā)式搜索法運(yùn)行5 000次自展重復(fù)（Bootstrap）檢驗各分支的置信度，BI 樹利用馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法（Markov chain Monte Carlo process，MCMC）運(yùn) 行200 萬代獲得各個分支的后驗概率（Posterior prob?ability，PP），其余為默認(rèn)參數(shù)；使用DnaSP 5.0軟件計算中性檢驗值Tajima’s和Fu and Li’s，并進(jìn)行錯配分布分析。

2 結(jié)果與分析

2.1序列變異及遺傳多樣性

通過對黃纓菊所有個體cpDNA 片段、和-分析，獲得序列長度為2 074 bp，（G+C）和（A+T）含量分別為37.6%、62.4%；cpDNA 片段含有26個變異位點，其中有16個堿基插入和缺失、8 個堿基顛換和2 個堿基轉(zhuǎn)換（見表1）?；谌~綠體DNA 片段的單倍型分析顯示，黃纓菊居群共檢測到6個單倍型（H1～H6），其中單倍型H1的出現(xiàn)頻率最高，單倍型H3、H5和H6為特有單倍型（見圖1）；將-、和-片段的單倍型序列分別提交至GenBank（MZ274274-274277、MZ312254-312255 和MZ312260-312263）。黃纓菊居群總的遺傳多樣性（）為3.101，范圍為0～0.533；總的核苷酸多樣性（）為0.008 903，范圍為0～0.003 525；參試居群中P1、P8～P9、P11～P13和P17 的遺傳多樣性水平高于其他居群（見表2）。每個居群的、、單倍型組成數(shù)量及頻率詳見表2。

表2 黃纓菊采樣信息及各居群遺傳多樣性Table 2 Sampling information and genetic diversity of X.subacaulis

2.2居群遺傳結(jié)構(gòu)

研究結(jié)果表明，黃纓菊居群內(nèi)平均遺傳多樣性=0.155，總的遺傳多樣性=0.451，居群間遺傳分化系數(shù)（0.727）大于（0.656），但不顯著（>0.05），說明黃纓菊在現(xiàn)有分布區(qū)域內(nèi)沒有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。AMOVA 分析結(jié)果顯示，黃纓菊居群間遺傳變異為68.98%，而居群內(nèi)遺傳變異為31.02%，=0.689 85（<0.01），表明黃纓菊的遺傳變異主要存在于居群間，且遺傳分化水平較高（見表3）。同時，黃纓菊居群間的基因流=0.025，顯示居群間基因流較小。此外，基于Mantel檢驗表明黃纓菊居群間平均遺傳距離與地理距離顯著正相關(guān)（=0.214，=0.01），即居群間地理距離越大其遺傳分化明顯（見圖2）。

表3 黃纓菊居群單倍型的AMOVA分析Table 3 Analyses of molecular variance（AMOVA）of haplotypes from populations in X.subacaulis

圖2 黃纓菊居群地理距離與遺傳距離的Mantel檢驗Fig.2 Mantel test between geographic and genetic distance of populations in X.subacaulis

2.3居群歷史動態(tài)

黃纓菊錯配分布分析顯示，其錯配分布曲線為單峰曲線（見圖3）；同時，Sum of squared devia?tion（SSD）值 為0.038（=0.109）和Harpending’s raggedness index值為0.167（=0.247），均不顯著（>0.05），符合種群擴(kuò)張模型假設(shè)，說明黃纓菊在現(xiàn)有分布區(qū)域內(nèi)經(jīng)歷過擴(kuò)張。然而，中性檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tajima’s=-1.070 35、Fu and Li’s=0.634 08，均不顯著（>0.05），表明黃纓菊居群沒有經(jīng)歷過擴(kuò)張現(xiàn)象，這與錯配分布分析的結(jié)果不同。此外，AMOVA 分析顯示，黃纓菊種群暴發(fā)前的種群大小=0，群暴發(fā)后的種群大小=99 999，有效種群大?。╡ffective population size）的變化范圍（～=0～999 99）非常高，認(rèn)為黃纓菊居群近期經(jīng)歷過擴(kuò)張。

圖3 黃纓菊居群cpDNA序列的錯配分布分析Fig.3 Mismatch distribution of cpDNA sequences from X.subacaulis

2.4單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

以葵花大薊（MZ312258、MZ312256、MZ312264）和 飛 廉（，MZ312259、MZ312257、MZ312265）為外類群，利用PhyloSuite 軟件基于最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建黃纓菊單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示黃纓菊6 個單倍型聚為3支（Clade Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），支持率達(dá)到80%以上。其中，單倍型H1、H2、H6 聚為一支（Clade Ⅰ），位于系統(tǒng)發(fā)育樹頂端，親緣關(guān)系較近；特有單倍型H3、H5 聚為一支（Clade Ⅱ），位于系統(tǒng)發(fā)育樹中部，具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；單倍型H4 位于發(fā)育樹的基部（Clade Ⅲ），獨(dú)自構(gòu)成一支（見圖4A）。同時，基于NETWORK 軟件構(gòu)建了黃纓菊的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)單倍型H1 位于網(wǎng)絡(luò)圖中央，占比最大（67%）。其中，單倍型H1 與H3、H4、H5 間以較多的突變步和“隱單倍型”（目前未檢測到的單倍型或已滅絕的古老單倍型）相連，表明本研究檢測到的單倍型應(yīng)該具有的獨(dú)立發(fā)育歷史（如單倍型H3、H4、H5），并且單倍型之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的親緣關(guān)系一致（見圖4B）。

圖4 黃纓菊單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹（A）和中央網(wǎng)絡(luò)連接圖（B）A.分支上的數(shù)字表示BI和ML的支持率，支持率小于80%未標(biāo)注；B.圓圈大小代表單倍型頻率，實心方塊代表“隱單倍型”Fig.4 Phylogenetic tree（A）and median-joining network（B）of haplotypes in X.subacaulisA.Numbers above branches are bootstrap values of BI and ML，and the support rate is less than 80% without marking；B.The size of circles repre?sents the haplotype frequency，and parallelogram represents missing haplotypes

3 討論

3.1居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于葉綠體DNA 群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，先前學(xué)者通過對青藏高原地區(qū)多種植物遺傳結(jié)構(gòu)的研究，表明該地區(qū)物種具有高的和低的，如西藏紅豆杉（；0.884，0.271）、西藏沙棘（0.956，0.372）、長花馬先蒿（0.770，0.332）、露蕊烏頭（0.739，0.207）、菊葉紅景天（；0.970，0.424）、偏花報春（；0.966，0.178）等。本研究結(jié)果顯示，黃纓菊居群也具有高的和低的（=0.451，=0.155），表明黃纓菊居群間葉綠體基因組分化明顯，進(jìn)一步驗證了先前研究結(jié)果的正確性和合理性。

同時，AMOVA 分析表明，黃纓菊68.98%的遺傳變異來源于居群間，而居群內(nèi)遺傳變異僅為31.02%，=0.689 85，=0.225，說明黃纓菊居群間遺傳分化程度較高。筆者認(rèn)為這是由于黃纓菊cpDNA 為母系遺傳，種子是其繁殖的主要方式，而該物種為墊狀草本植物，葉邊具刺，種子無利于傳播的附屬結(jié)構(gòu)，加之黃纓菊主要生長于青藏高原地區(qū)地形復(fù)雜的草甸、草原及干燥山坡，使居群間基因交流受阻，主要發(fā)生于居群內(nèi)；并且Mantel 檢驗的結(jié)果也進(jìn)一步支持這一結(jié)論。然而，通過分析黃纓菊群體遺傳分化系數(shù)和，發(fā)現(xiàn)>（>0.05），該物種在分布范圍內(nèi)不存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)，這與其他許多高山植物如菊葉紅景天（=0.655，=0.652）、東俄洛橐吾（；=0.614，=0.595）、銀露梅（；=0.864，=0.720）等的譜系地理結(jié)構(gòu)一致。

3.2冰期避難所及居群進(jìn)化歷史推測

第四紀(jì)冰期氣候動蕩對植物地理分布產(chǎn)生重大影響，尤其對青藏高原植物類群的群體遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化歷史影響更為劇烈。于海彬等通過對青藏高原地區(qū)36種高山植物譜系地理分布格局的綜合分析，提出該地區(qū)植物主要具有“退縮—回遷”和“微型避難所”兩種模式。他們認(rèn)為，符合“退縮—回遷”模式的植物第四紀(jì)冰期時常退縮到高原邊緣避難所，冰期后回遷到高原臺面，即遺傳多樣性較高或古老單倍型較多的居群通常聚集于高原邊緣避難所，高原邊緣居群的遺傳多樣性較高，而高原臺面居群的遺傳多樣性較低；而符合“微型避難所”模式的植物第四紀(jì)冰期時，并非所有居群都向高原邊緣遷移，有部分居群可在本地適宜的微環(huán)境中生存，從而在高原臺面形成一個或多個不連續(xù)的微型避難所，冰期后從高原臺面原生避難所向外擴(kuò)張，即高原臺面避難所居群的遺傳多樣性較高。

溯祖理論認(rèn)為，位于單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中心的單倍型通常為古老單倍型，因而本研究中的單倍型H1 應(yīng)為黃纓菊居群的古老單倍型，因此擁有單倍型H1 的居群所在的區(qū)域可以推斷為冰期避難所；同時，本研究結(jié)果顯示分布于青海湖流域的黃纓菊居群遺傳多樣性和核苷酸多樣性偏高，而其他區(qū)域的遺傳多樣性和核苷酸多樣性較低。據(jù)此，筆者認(rèn)為青海湖流域很可能是黃纓菊的冰期避難所。一方面，青海湖流域四面環(huán)山的有利地形為其成為黃纓菊第四紀(jì)冰期的避難所提供了地理條件；另一方面，青海湖流域充足的光照和水分為黃纓菊生存提供必備的環(huán)境條件。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)甘肅南部的黃纓菊居群P18 也具有豐富的遺傳多樣性和單倍型多樣性，認(rèn)為該區(qū)域可能是黃纓菊第四紀(jì)冰期的另一個避難所。這與先前諸多高山植物如露蕊烏頭、西川紅景天等的第四紀(jì)冰期避難所的模式相同。此外，黃纓菊錯配分布曲線為單峰曲線，偏離總方差（SSD）和粗糙指數(shù)（）不顯著，有效種群大小為0～999 99，均支持黃纓菊居群經(jīng)歷過近期擴(kuò)張。

總之，本研究認(rèn)為冰期氣候動蕩和青藏高原隆升共同塑造了黃纓菊的現(xiàn)代地理分布格局，這為今后系統(tǒng)研究黃纓菊的進(jìn)化歷史和物種形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。