李艾元, 施心雨, 劉夢(mèng)斐, 李 誠(chéng), 岳萬福, 游衛(wèi)云

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,杭州 311300)

大量的流行病學(xué)調(diào)查和研究表明,高脂血癥是目前動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和腦血管病發(fā)病的最重要因素[1-3]。高脂血癥也是高血壓、糖耐量異常、糖尿病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[4]。高脂血癥還可導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化、膽石癥、胰腺炎、眼底出血、失明、周圍血管疾病、跋行、高尿酸血癥[5]。降脂藥可降低這些疾病的發(fā)生率和死亡率,對(duì)心腦血管疾病的防治產(chǎn)生積極、深遠(yuǎn)的影響[6]。目前臨床應(yīng)用和處在研發(fā)階段的降脂藥物按其降脂機(jī)理和化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為他汀類、煙酸類、貝特類、膽酸鰲合劑類、多烯類、中藥類等[7];他汀類藥物,例如辛伐他汀(SIM)和阿托伐他汀(ATV)的藥理功能是抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR),這是肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶。但現(xiàn)有的降脂藥物存在療效不佳、毒副作用較大或費(fèi)用高等問題,因此開發(fā)新的降脂藥物顯得非常必要[8]。

大量研究表明,從自然資源中提取的大量生物化合物可以改善脂質(zhì)代謝紊亂,因?yàn)樗鼈儗?duì)高脂血癥的療效很高,并且很少或沒有不良副作用。其作用機(jī)理主要有三個(gè)方面:1) 降低血漿中的脂質(zhì)水平,具有抗動(dòng)脈粥樣硬化活性;2) 降低血清中的總膽固(TC)和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平;3) 通過調(diào)節(jié)腸道微生物群組成來發(fā)揮降血脂作用。蠶絲生物材料因其生物相容性和廣泛的理想物理化學(xué)性質(zhì),在生物醫(yī)學(xué)和組織工程方面的應(yīng)用而聞名[9]。脫膠絲素蛋白已經(jīng)在小鼠、綿羊、兔子、人類等哺乳動(dòng)物細(xì)胞證明了絲素蛋白對(duì)宿主無免疫排斥和綠色可降解[10-11]。絲素蛋白可促進(jìn)多種因子表達(dá),降解的氨基酸可以被宿主動(dòng)物吸收降解而沒有副作用[12]?？梢試L試作為降血脂藥物的輔料來減少藥物的毒副作用,或者單獨(dú)作為藥物替代產(chǎn)物來減緩高血脂的病癥[13]。

斑馬魚與普通的模型動(dòng)物相比,具有以下特性:1) 飼養(yǎng)成本低,性成熟周期短[14];2) 生長(zhǎng)發(fā)育速度較快,在受精后24 h基本器官就可以發(fā)育完成;3) 胚胎及幼魚透明便于觀察藥物在體內(nèi)的擴(kuò)散及吸收情況[15];4) 給藥方式簡(jiǎn)單,培養(yǎng)基內(nèi)直接給藥,溶于水的小分子物質(zhì)可直接通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入幼魚體內(nèi)[16];5) 與人類基因具有85%相似性[6]。因此,使用斑馬魚可以評(píng)價(jià)絲素蛋白能否在降血脂方面的效用[17-19]。總的來說,斑馬魚具有體積小、產(chǎn)卵量高、發(fā)育迅速、胚胎及幼體透明等特點(diǎn),并且與人類基因組具有高度同源性。

1 步驟與方法

1.1 材料與試劑

斑馬魚及斑馬魚培養(yǎng)基(南京一樹梨花生物科技有限公司),絲素蛋白(杭州林然生物科技有限公司),熒光倒置顯微鏡(尼康映像儀器銷售(中國(guó))有限公司北京分公司),PBST緩沖液、油紅O、二甲基亞砜(DMSO)、尼羅紅(北京索萊寶科技有限公司),其余未列出試劑(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 斑馬魚高血脂模型的建立與檢測(cè)

斑馬魚模型建立方法:采用文獻(xiàn)[20-21]的方法,利用幼魚循環(huán)系統(tǒng)可以與培養(yǎng)基進(jìn)行物質(zhì)交換的特性,在顯微鏡下挑選孵化后發(fā)育正常的斑馬魚卵放入96孔板,每孔各一個(gè)魚卵,加入0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的蛋黃培養(yǎng)液及空白組(養(yǎng)殖用水)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,觀察魚卵的情況,及時(shí)挑出死掉的幼魚。

模型的檢測(cè)方法:移除蛋黃培養(yǎng)液之后,PBS洗脫3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,PBST洗脫3次,熒光倒置顯微鏡觀察拍照。用圖像處理軟件ImageJ和SPSS 22.0進(jìn)行圖像分析比較,計(jì)算處理組斑馬魚尾部血脂染色強(qiáng)度與空白組尾脂染色強(qiáng)度,可以檢驗(yàn)斑馬魚高血脂模型是否建立成功。同時(shí),挑選出4組濃度中模型建立最好的一組,作為高血脂模型進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 斑馬魚實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組:3個(gè)化合物處理組、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組、1個(gè)溶劑對(duì)照組、1個(gè)空白對(duì)照組。移除96孔板中的培養(yǎng)基,PBS洗3次,化合物處理組分別加入0.1、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的辛伐他汀和同等質(zhì)量濃度絲素蛋白;陽(yáng)性對(duì)照組中加入0.05 μg/mL的辛伐他汀;溶劑對(duì)照組中加入0.10% DMSO;空白對(duì)照組中加入養(yǎng)殖用水,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 斑馬魚高血脂熒光染色

移除培養(yǎng)液之后,PBS洗脫3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,PBST洗脫3次,熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

1.5 斑馬魚染色與結(jié)果分析

將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板中,每孔一尾,移除蛋黃培養(yǎng)基后用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,放入倒置熒光顯微鏡中觀察熒光強(qiáng)度。將所得數(shù)據(jù)按照下式進(jìn)行SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析。

(1)

式中:A表示處理組染色強(qiáng)度;B表示對(duì)照組染色強(qiáng)度;C表示血脂降低率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用圖像處理軟件ImageJ和SPSS 22.0進(jìn)行圖像分析比較,計(jì)算模型組斑馬魚尾部血脂染色強(qiáng)度與空白組尾脂染色強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以±SE表示,多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用Dnnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為差異性顯著。最后,根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果評(píng)價(jià)絲素蛋白的降血脂能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚模型建立與結(jié)果分析

斑馬魚高血脂的造模原理主要是:高膽固醇的飲食,通過斑馬魚的循環(huán)系統(tǒng)在體內(nèi)血管不斷積累,血液中的膽固醇逐漸升高,從而影響尾脂熒光染色的面積和強(qiáng)度。由圖1(a～f)可以看出,隨著培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,斑馬魚尾脂的染色強(qiáng)度與面積逐漸增加。圖1(i)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,培養(yǎng)基不添加蛋黃粉的斑馬魚幼苗尾脂沒有檢測(cè)出熒光強(qiáng)度,培養(yǎng)基添加蛋黃粉的斑馬魚幼苗檢測(cè)出熒光強(qiáng)度。各個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋黃粉培養(yǎng)基的熒光染色結(jié)果相比可以得出,培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%時(shí),與其他蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異極顯著(P<0.001);培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%時(shí),與0.05%質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著(P>0.05),與0.01%質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異顯著(P<0.05)。隨著培養(yǎng)基中的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,斑馬魚高血脂的癥狀逐漸增加。0.50%的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)造模效果最佳,但0.50%蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),已經(jīng)超過斑馬魚幼苗的耐受度,斑馬魚死亡率較高,達(dá)50%;而在0.01%～0.10%蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù),死亡率均在20%±5%。綜合分析比較得出,最佳的造模條件為0.10%的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此,選擇含0.10%蛋黃粉的培養(yǎng)基進(jìn)行造模。油紅O染色可進(jìn)一步驗(yàn)證造模是否成功,如圖1(g)為不含蛋黃粉斑馬魚幼苗染色結(jié)果,未見到尾脂被染色;圖1(h)為含0.01%的蛋黃粉斑馬魚幼苗染色,幼苗的尾脂被染色,整個(gè)尾脂都被油紅O成功染色。油紅O結(jié)果表明,造模成功的斑馬魚尾脂可以被染色,而未經(jīng)蛋黃溶液培養(yǎng)的斑馬魚尾脂沒有被染色。從組織化學(xué)和免疫熒光兩個(gè)方面證明了斑馬魚高血脂模型的科學(xué)性與可行性。

注:*表示P<0.05,** 表示P<0.01,*** 表示P<0.001;下同。

2.2 絲素蛋白與辛伐他汀處理組結(jié)果的分析與比較

由圖2的結(jié)果可以看出,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)的絲素蛋白與高質(zhì)量濃度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)相比,熒光強(qiáng)度沒有差異(P>0.05);絲素蛋白中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)與辛伐他汀中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)相比,熒光效果差異極顯著(P<0.001);絲素蛋白低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)和辛伐他汀低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)相比差異極顯著(P<0.001);兩者的溶劑對(duì)照組沒有差異(P>0.05)。比較分析可以得出,絲素蛋白在中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)具有更好的降血脂效果。整體趨勢(shì)來看,隨著絲素蛋白質(zhì)量濃度和辛伐他汀質(zhì)量濃度的提高,尾脂的熒光強(qiáng)度逐漸下降,斑馬魚血脂下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,絲素蛋白可以通過濃度差進(jìn)入到斑馬魚體內(nèi),通過血液循環(huán)發(fā)揮作用,絲素蛋白具有類似他汀類藥物的降血脂作用。此外,對(duì)于幼年斑馬魚來說,主要靠吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育,絲素蛋白利用濃度差進(jìn)入高血脂斑馬魚的血液循環(huán)中,降解為氨基酸,其中賴氨酸和蛋氨酸這類限制性氨基酸可以影響魚類生長(zhǎng)基因和相關(guān)蛋白質(zhì)代謝,這類限制性氨基酸可以增強(qiáng)肝的代謝;絲素蛋白質(zhì)量濃度越高,濃度差越大,進(jìn)入血液循環(huán)的限制性氨基酸越多,肝的代謝得到增強(qiáng),血液中的脂質(zhì)水平下降,斑馬魚的尾脂熒光強(qiáng)度降低。而對(duì)于他汀類藥物來說,其藥理作用是抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)的作用,這是肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶,這種抑制作用只可以阻止新的膽固醇合成,一時(shí)間無法快速緩解高血脂斑馬魚血液中的脂質(zhì)水平,隨著他汀類藥物質(zhì)量濃度的提高,血液中沒有了膽固醇的來源,可以通過循環(huán)將血液的膽固醇逐漸新陳代謝出去,從而導(dǎo)致血液中的脂質(zhì)水平下降,這也可以解釋為什么他汀類藥物質(zhì)量濃度越高,抑制效果越明顯。綜上,各個(gè)質(zhì)量濃度的絲素蛋白均可以降低高血脂斑馬魚的高血脂水平。

圖2 絲素蛋白和辛伐他汀處理組的結(jié)果比較

2.3 辛伐他汀處理組結(jié)果分析與比較

由圖3的結(jié)果可以看出,與溶劑對(duì)照組熒光強(qiáng)度相比,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)辛伐他汀藥物處理的高血脂斑馬魚具有顯著性差異(P<0.001);中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)差異不顯著(P>0.05);其中低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)熒光強(qiáng)度有下降的趨勢(shì),但差異不顯著。這種結(jié)果與他汀類藥物的作用原理有關(guān),在更換培養(yǎng)基之后,斑馬魚血液中的外源膽固醇不再增加,膽固醇主要來自體內(nèi),但是如果辛伐他汀的質(zhì)量濃度過低,無法完全抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶,膽固醇仍然被加工出來,因此斑馬魚中的尾脂熒光水平?jīng)]有得到有效降低。圖3(b)為圖3(a)數(shù)值代入式(1)的結(jié)果,也證實(shí)了辛伐他汀中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)有降低血脂水平的效果,但是只有高質(zhì)量濃度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)可以高度抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶。高質(zhì)量濃度的辛伐他汀藥物雖然可以降低血脂,但是質(zhì)量濃度過高,可能會(huì)對(duì)肝功能造成不可逆的損傷,因此他汀類藥物本身具有一定的局限性。

圖3 辛伐他汀處理結(jié)果分析

2.4 絲素蛋白處理組結(jié)果分析與比較

由圖4(a)的結(jié)果表明,與陽(yáng)性對(duì)照組(0.05 μg/mL)辛伐他汀相比,絲素蛋白在高質(zhì)量濃度組(1.0 μg/mL)和中質(zhì)量濃度組(0.5 μg/mL)均差異極顯著(P<0.001);低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)差異不顯著(P>0.05);而圖4(b)血脂降低率則表明,與絲素蛋白低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)相比,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)和中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)差異極顯著(P<0.001),絲素蛋白質(zhì)量濃度對(duì)降血脂效果影響較大。絲素蛋白通過濃度差進(jìn)入到斑馬魚的血液循環(huán)中,之后在血液循環(huán)的作用下降低血液中的膽固醇含量,從而降低尾脂的熒光強(qiáng)度。質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)則表明,絲素蛋白也需要一定的質(zhì)量濃度才可以發(fā)揮它的作用,質(zhì)量濃度越高,降血脂效果越顯著,但是絲素蛋白中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)與高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)相比,降血脂的效果差異不顯著(P>0.05)。綜上,絲素蛋白對(duì)降血脂的提升效果最好是在0.5～1.0 μg/mL。

圖4 絲素蛋白處理結(jié)果

3 結(jié) 論

本文提供了一種可信度高的斑馬魚高血脂模型,操作簡(jiǎn)便、過程簡(jiǎn)單,可以用來篩選其他高血脂藥物;同時(shí)探究了絲素蛋白對(duì)高血脂斑馬魚降血脂的效果,主要有以下結(jié)論。

1) 利用含0.1%蛋黃粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)斑馬魚幼苗48 h就可以得到斑馬魚高血脂模型,模型可用免疫熒光和油紅O方法檢測(cè)。

2) 采用市面上成熟的降血脂藥物辛伐他汀進(jìn)一步驗(yàn)證了高血脂斑馬魚可以通過尾脂的熒光染色顯示降血脂效果。

3) 各個(gè)質(zhì)量濃度的絲素蛋白均有降血脂的效果,其中高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)降血脂效果最好。

4) 與辛伐他汀相比,絲素蛋白在低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)和中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)的降血脂效果更好。

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