李曉晗, 路瑩瑩, 董永貞, 江 豐, 范志勇,潘 暉, 劉明軍, 陳翊平*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北 武漢 430070; 2. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院, 湖北 武漢 430071; 3. 荊州市食品藥品檢驗所, 湖北 荊州 434000)

谷物在生長、儲存和運輸過程中容易受到真菌毒素污染。黃曲霉毒素作為真菌毒素的代表種類之一,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強致癌物[1],其中黃曲霉毒素B1(AFB1)為Ⅰ類致癌物,毒性極強,即使在低水平下也可能導(dǎo)致肝臟受損,從而誘發(fā)癌癥,危及生命。由于AFB1的明顯毒性效應(yīng),GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》明確了糧油谷物中黃曲霉毒素的限量,規(guī)定玉米、大米和小麥中AFB1分別不得超過20、10和5 μg/kg[2]。因此,即使在谷物樣品中以極微量存在的AFB1,其毒性也不容忽視。且谷物中含有較多的淀粉和脂肪,這無疑增加了樣品提取富集的難度[3],對樣品中的痕量AFB1進行充分、快速提取,對檢測準確性和檢測效率至關(guān)重要[4]。因此建立一種基于高效前處理技術(shù)的準確分析方法對谷物中痕量AFB1的檢測具有重要意義。

目前,谷物中AFB1的檢測方法主要是薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[5,6]。其中,薄層色譜法的靈敏度較低,實驗操作較為繁瑣且重復(fù)性較差[7];酶聯(lián)免疫吸附法需要重復(fù)洗滌,耗時較長[8]; HPLC多采用紫外檢測器,靈敏度較低,而HPLC-MS/MS將質(zhì)譜作為檢測器,適用性非常廣泛,其同時具備質(zhì)譜的高靈敏度與HPLC的高分離性,能夠?qū)崿F(xiàn)AFB1的高效、準確、靈敏的定量定性檢測,從而彌補HPLC技術(shù)的不足[9]。郭芳芳等[10]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對小麥粉中AFB1進行檢測,結(jié)果顯示線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999,定量限為0.1 μg/kg,且加標回收率可達90.3%。目前對于黃曲霉前處理方法的研究主要集中在固相萃取小柱和免疫親和柱上,而對于磁性納米材料的研究則較少。趙穎等[11]采用核酸適配體親和柱進行凈化,其柱容量可達(334.6±18.2) ng,隨后結(jié)合HPLC對蓮子中的AFB1進行定量分析;Zhao等[12]采用多毒素復(fù)合免疫親和柱,結(jié)合HPLC-MS/MS實現(xiàn)了中藥中6種真菌毒素的同時檢測,檢出限(LOD)為7 pg/mL,定量限(LOQ)為20 pg/mL。雖然免疫親和柱能夠較好地實現(xiàn)痕量AFB1的提取效果,但其成本很高,因此針對谷物中的痕量AFB1亟須開發(fā)一種簡單、快速、低成本的前處理方法[13]。本方法合成了一種抗體(Ab)-SiO2@Fe3O4磁性納米材料,其偶聯(lián)的AFB1抗體可以定向捕獲谷物樣品中的AFB1,磁分離后可實現(xiàn)目標分析物AFB1與樣品復(fù)雜基質(zhì)的快速分離,大大提高了前處理效率。

基于此,本研究利用Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料對谷物樣品中的AFB1進行免疫磁分離富集,將該材料捕獲的AFB1洗滌下來,結(jié)合HPLC-MS/MS對大米、玉米、小麥3種谷物樣品中的AFB1進行高效準確檢測。該磁性納米材料具有合成方法簡單、與復(fù)雜基質(zhì)分離快速的優(yōu)點,且基于該材料分離富集的前處理過程操作簡單、方便、無需多次洗脫,為谷物中痕量黃曲霉毒素的快速分離富集和準確測定提供了簡單高效的手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

SiO2@Fe3O4磁性納米材料的形貌通過Zeiss Gemini300透射電子顯微鏡(TEM)進行表征,粒徑通過Nano ZS動態(tài)光散射(DLS)進行表征,化學(xué)成分通過IS50傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)進行表征。SuperMag磁性分離架購自美國Ocean NanoTech公司,MKX-H2C1微波合成儀購自青島邁可威微波應(yīng)用技術(shù)有限公司。Xevo TQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、0.22 μm有機濾膜購自美國Waters公司,實驗用水為Milli-Q型超純水,超純水機購自美國Millipore公司。MX-S可調(diào)式混勻儀購自南京潤耀生物科技有限公司,BX超聲波清洗機購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司,NDK200-2N型氮吹儀購自杭州米歐儀器有限公司。

AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)標準品購自上海源葉生物科技有限公司,純度均大于98%; Ab(2 mg/mL)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留實驗室提供。(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,購自德國默克公司。使用的所有其他化學(xué)品和試劑均為分析純。大米、玉米和小麥3種谷物樣本均從當?shù)厥袌鲑徺I并密封,置于-20 ℃保存使用。

1.2 Ab-SiO2@Fe3O4的合成

1.2.1Fe3O4磁性納米顆粒的合成

采用微波輔助水熱法[14]合成Fe3O4磁性納米顆粒,將10.0 mmol六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、4.0 mmol三水合醋酸鈉(NaAc·3H2O)和3.0 mmol十二烷基磺酸鈉(SDS)溶解在25 mL乙二醇中。攪拌后將混合物轉(zhuǎn)移到50 mL微波合成反應(yīng)容器中,設(shè)置微波合成儀的加熱參數(shù)。第一加熱段為150 ℃下加熱20 min,第二加熱段為200 ℃下加熱40 min,冷卻至室溫,用10 mL去離子水和無水乙醇交替洗至中性,真空干燥,在常溫下保存。

1.2.2SiO2@Fe3O4的合成

為了增加Fe3O4磁性納米顆粒的親水性,利于后續(xù)基團修飾,采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對Fe3O4磁性納米顆粒的性狀進行改良,隨后進行二氧化硅的包覆[9,15]。取10 mg Fe3O4磁性納米顆粒與1 g PVP在20 mL純水中反應(yīng)1 h,用75%乙醇洗滌。加入1 mL氨水、100 μL TEOS,用乙醇稀釋到10 mL,攪拌30 min。隨后進行磁分離、干燥、研磨,在常溫下保存。

1.2.3Ab-SiO2@Fe3O4的制備

在上一步制得的SiO2@Fe3O4磁性納米材料中加入10%(v/v)APTES水溶液使其氨基化,隨后進行抗體的偶聯(lián)。在SiO2@Fe3O4磁性納米材料中加入40 μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC, 5 mg/mL)、20 μLN-羥基琥珀酰亞胺(NHS, 5 mg/mL)和440 μL 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶液(10 mol/L, pH=6.5),混勻后加入100 μg AFB1抗體,在37 ℃下翻轉(zhuǎn)混勻60 min。最后用磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.05 mol/L, pH=7.4)洗滌除去未結(jié)合的抗體,于4 ℃下保存,待使用。

1.3 谷物中AFB1的提取

將10 mL乙腈-水-甲酸(85∶10∶5, v/v/v)溶液加入大米、玉米、小麥3份谷物樣品(均為5 g)中渦旋混勻,超聲提取10 min, 7 000 r/min下離心5 min,取上清液氮吹后采用10 mL PBS(pH=7.4)復(fù)溶,于4 ℃下儲存。

1.4 Ab-SiO2@Fe3O4的分離富集

向1.3節(jié)得到的10 mL提取液中加入8 mg Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料,在37 ℃下渦旋混勻10 min,磁分離后棄去上清液,采用1 mL甘氨酸-鹽酸(Gly-HCl)緩沖液(0.1 mol/L,含2% Tween-20)[16]對磁分離后剩余的Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料進行洗脫,將其捕獲的AFB1洗滌下來。隨后再次磁分離,將上清液氮吹至近干,用1 mL乙腈復(fù)溶,過0.22 μm濾膜待進樣檢測。

1.5 Ab-SiO2@Fe3O4的富集能力計算

Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料對AFB1的捕獲能力由下式計算:

(1)

式中,Qe為Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料達到富集平衡時的捕獲能力(mg/g),C0為溶液中AFB1的初始質(zhì)量濃度(μg/L),Ce為達到富集平衡時溶液中剩余AFB1的質(zhì)量濃度(μg/L),m為添加的Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料的質(zhì)量(mg),V為AFB1溶液的體積(mL)。

1.6 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱為ACQUITY BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫為35 ℃;進樣量為2 μL,流速為0.3 mL/min;流動相為含0.1%甲酸的乙腈,等度洗脫,所有流動相在使用前通過0.22 μm濾膜過濾,并在超聲中脫氣。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源;質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;噴霧電壓為4.5 kV,噴霧電流為8 μA;鞘氣N2(99.99%),流量35 L/min;輔助氣體N2(99.99%),流量5 L/min;離子傳輸毛細管溫度300 ℃;毛細管電壓16 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ab-SiO2@Fe3O4合成條件的優(yōu)化

2.1.1SiO2包覆條件優(yōu)化

圖 1 (a)FeCl3·6H2O用量、(b)時間和(c)主加熱階段溫度 對Fe3O4磁性納米顆粒粒徑分布的影響 Fig. 1 Effects of (a) FeCl3·6H2O dosage, (b) time and (c) temperature in the main heating stage on Fe3O4 magnetic nanoparticle size distribution

為了合成性能優(yōu)異的Fe3O4磁性納米顆粒,采用3組單因素實驗對FeCl3·6H2O的用量(溫度為200 ℃,時間為40 min)以及主加熱階段(第二加熱階段)的時間(溫度為200 ℃, FeCl3·6H2O的用量為10.0 mmol)和溫度(FeCl3·6H2O的用量為10.0 mmol,時間為40 min)進行了優(yōu)化。采用DLS比較不同條件下合成的Fe3O4磁性納米顆粒的粒徑分布。結(jié)果表明,Fe3O4的粒徑隨著FeCl3·6H2O用量和加熱時間的增加而增加,這與之前的研究結(jié)果相似[17],說明微波輔助水熱合成法和經(jīng)典水熱方法具有相同的促反應(yīng)機理,并且當FeCl3·6H2O的用量為10.0 mmol(見圖1a)、第二加熱階段的加熱時間為40 min(見圖1b)時具有相對均勻的粒徑分布,峰寬較窄。而Fe3O4磁性納米顆粒的粒徑隨著第二加熱階段加熱溫度的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢,這是由于較高的反應(yīng)溫度能夠提高反應(yīng)速率,加快反應(yīng)的進行,從而加速晶核的形成和生長,但反應(yīng)溫度過高,會導(dǎo)致一些粒徑較大的磁性納米粒子破裂或變?yōu)榭招臓顟B(tài),從而導(dǎo)致產(chǎn)物不純,粒徑不均(見圖1c)。因此選擇200 ℃作為合成溫度,在這一條件下制備的Fe3O4磁性納米顆粒粒徑分布均勻、分散性好,有利于后續(xù)SiO2的表面修飾,實現(xiàn)更加有效的分離富集過程。

圖 2 TEOS用量對(a)SiO2@Fe3O4粒徑分布和 (b)磁分離時間的影響(n=3)Fig. 2 Effects of tetraethoxysilane (TEOS) dosage on (a) SiO2@Fe3O4 particle size distribution and (b) magnetic separation time (n=3)

以Fe3O4磁性納米顆粒為原料進一步合成了SiO2@Fe3O4磁性納米材料,其中SiO2包覆層的厚度對材料的磁性、分散性都有一定的影響。我們采用動態(tài)光散射法得出不同TEOS溶液用量(60、80、100、120 μL)下合成的SiO2@Fe3O4的粒徑分布曲線,從而確定SiO2包覆層的厚度和材料均勻性;用去離子水將一定質(zhì)量的SiO2@Fe3O4配制成0.01 mg/mL的溶液,取10 mL SiO2@Fe3O4溶液于量筒中,采用溶液中的SiO2@Fe3O4磁性納米材料在量筒底部外加磁場的存在下完全沉降到底部所需的時間作為磁分離時間,用來反映磁性納米材料的磁性能。磁分離時間越短,說明磁性納米材料的磁性能就越強。由圖2可知,隨著TEOS用量的增加磁顆粒的沉降時間逐漸增加,主要是因為TEOS的用量與SiO2包覆層厚度成正相關(guān),從而影響磁顆粒的沉降時間。當采用TEOS的用量為100 μL時,粒徑分布均勻,峰寬最窄,47.18%的SiO2@Fe3O4磁性納米材料的粒徑分布在270～290 nm之間,且在4 s內(nèi)就可以完成磁分離,具有較好的均勻性和磁性能。

2.1.2抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

抗體的偶聯(lián)是最為關(guān)鍵的一步,本實驗通過BCA蛋白濃度測定試劑盒對SiO2@Fe3O4捕獲的抗體量進行測定,分別對偶聯(lián)過程中EDC與NHS物質(zhì)的量之比、MES的pH值、MES的濃度以及偶聯(lián)時間進行優(yōu)化。如圖3a所示,Ab與SiO2@Fe3O4磁性納米材料的偶聯(lián)效率明顯受到EDC與NHS物質(zhì)的量之比的影響,當EDC∶NHS為2∶1時,偶聯(lián)效率逐漸增加,即與SiO2@Fe3O4磁性納米材料結(jié)合的抗體逐漸增加,偶聯(lián)率可達到76.47%～90.58%。這是由于抗體上的羧基在較多EDC存在的條件下可以形成不穩(wěn)定的中間體,而NHS可以與該中間體結(jié)合形成穩(wěn)定的活性酯附著在磁性納米粒子表面,從而實現(xiàn)抗體的偶聯(lián)[18],如EDC占比過低,會對中間體的形成造成一定影響,導(dǎo)致抗體與SiO2@Fe3O4的偶聯(lián)效率下降。隨后比較了MES溶液不同pH值(6.0、6.5、7.0)以及不同MES濃度(10、50、100 mmol/L)對抗體偶聯(lián)率的影響。結(jié)果表明,隨著MES濃度的增加,偶聯(lián)率逐漸降低,當采用pH=6.5、濃度為10 mmol/L的MES作為偶聯(lián)緩沖液時表現(xiàn)出最佳偶聯(lián)效果,偶聯(lián)率可以達到88.79%(見圖3b)。最后對抗體的偶聯(lián)時間做了優(yōu)化,如圖3c所示,隨著時間的延長,抗體在SiO2@Fe3O4上的偶聯(lián)率逐漸增加,在60 min時增長變緩慢,Ab與SiO2@Fe3O4磁性納米材料的結(jié)合趨于飽和,因此選取60 min作為最佳偶聯(lián)時間。

圖 3 (a)EDC與NHS的物質(zhì)的量之比、(b)MES的pH、濃度與(c)偶聯(lián)時間對抗體偶聯(lián)效率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of (a) the ratio of the amount of EDC to NHS, (b) pH, concentration of MES and (c) coupling time on antibody coupling efficiency (n=3) EDC: 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride; NHS: N-hydroxysuccinimide substances; MES: 2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate.

2.2 SiO2@Fe3O4的表征

分別采用TEM、DLS、FT-IR對SiO2@Fe3O4的形貌、基團分布和粒徑分布進行表征,證明材料的成功合成。由圖4a可知,SiO2@Fe3O4的分散性較好,未發(fā)生團聚,粒徑約為280 nm, SiO2包覆層的厚度約為25 nm。圖4b為材料的粒徑分布圖,大約68.3%的Fe3O4磁性納米顆粒的粒徑分布在260 nm左右,所占比例較高,說明合成的Fe3O4磁性納米顆粒分布較為均勻。約44.6%的SiO2@Fe3O4的粒徑分布在275～285 nm之間,進一步說明了SiO2在Fe3O4磁性納米顆粒上的成功包覆,包覆厚度大約為25 nm,與TEM的表征結(jié)果對應(yīng)。圖4c為Fe3O4磁性納米顆粒、SiO2@Fe3O4和Ab-SiO2@Fe3O4的紅外光譜圖,SiO2@Fe3O4在1 026 cm-1、1 098 cm-1處出現(xiàn)了Si-O鍵的伸縮振動峰,Ab-SiO2@Fe3O4在1 652 cm-1處出現(xiàn)了抗體的酰胺鍵的峰,屬于酰胺Ⅰ帶,說明SiO2在Fe3O4磁性納米顆粒上的成功包覆和抗體的成功偶聯(lián),成功合成了Ab-SiO2@Fe3O4用于后續(xù)AFB1的分離富集。

圖 4 SiO2@Fe3O4的(a)透射電子顯微鏡、(b)動態(tài)光散射和(c)傅里葉變換紅外光譜表征Fig. 4 (a) Transmission electron microscopy (TEM), (b) dynamic light scattering (DLS) and (c) fourier transform-infrared spectroscopy (FT-IR) characterizations of SiO2@Fe3O4

2.3 Ab-SiO2@Fe3O4對AFB1分離富集條件優(yōu)化

2.3.1吸附條件的優(yōu)化

Ab-SiO2@Fe3O4對于AFB1的分離富集條件是影響材料應(yīng)用效果的重要外部因素,本實驗分別考察了所用PBS的pH、富集溫度、Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料用量、富集時間對材料回收率的影響。取1 mL AFB1標準溶液(10 μg/mL,溶于pH=7.4的PBS),在不同條件下按照1.4節(jié)所述步驟進行AFB1的分離富集,采用HPLC-MS/MS測定回收率。如圖5a所示,Ab-SiO2@Fe3O4對AFB1的回收率隨著緩沖液pH值的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢,這主要歸因于抗體與抗原在中性條件下具有較好的結(jié)合效率,因此后續(xù)采用pH=7.4的PBS溶液作為緩沖溶液。由圖5b可知,富集溫度為37 ℃時回收率最高,這由于37 ℃是免疫反應(yīng)的最適溫度[19]。圖5c結(jié)果顯示隨著Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料用量的增加,AFB1溶液的回收率逐漸增加,當用量達到8 mg后,回收率不再發(fā)生明顯變化,因此選擇8 mg作為最佳Ab-SiO2@Fe3O4用量。圖5d為達到富集平衡所需要的時間,富集10 min后回收率趨于平緩,表明已接近飽和狀態(tài),因此選擇10 min作為富集時間。

圖 5 (a)緩沖液pH、(b)富集溫度、(c)材料用量和(d)富集時間對AFB1回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effects of (a) buffer pH, (b) enrichment temperature, (c) material dosage and (d) enrichment time on the aflatoxin B1(AFB1) recoveries (n=3)

2.3.2洗滌條件的優(yōu)化

查閱文獻[16]可知,Gly-HCl酸化液可促進抗原抗體復(fù)合物的解離,且添加一定濃度的去垢劑可進一步提升解離效果。因此選擇在0.1 mol/L的Gly-HCl緩沖溶液中加入1%、2%、5%、10%的Tween-20或0.5%、1%、2%、5%的SDS,探究不同溶液對AFB1的洗滌效果。取1 mL AFB1標準溶液(10 μg/mL,溶于pH=7.4的PBS)在不同條件下按照1.4節(jié)所述步驟進行AFB1的分離富集,采用HPLC-MS/MS測定回收率。結(jié)果表明,在Gly-HCl緩沖溶液中添加2%的Tween-20時,可以達到最佳洗滌效果,回收率為96.57%,因此采用含有2%的Tween-20的Gly-HCl緩沖液將Ab-SiO2@Fe3O4分離富集的AFB1洗滌下來,進行后續(xù)試驗。

2.4 Ab-SiO2@Fe3O4的性能驗證

2.4.1分離富集能力驗證

圖 6 (a)Ab-SiO2@Fe3O4與Ab-Fe3O4的富集能力和(b)材料特異性(n=3)Fig. 6 (a) Enrichment capacities of Ab-SiO2@Fe3O4 and Ab-Fe3O4 and (b) specificities of Ab-SiO2@Fe3O4 materials (n=3) OTA: ochratoxin A; DON: deoxynivalenol; ZEN: zearalenone.

選擇OTA、DON、ZEN 3種真菌毒素作為干擾物來驗證Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料對AFB1的特異性結(jié)合性能。如圖6b表明,在相同的加標濃度下,該磁性納米材料對AFB1的回收率大大高于其他3種真菌毒素,說明該材料對AFB1具有出色的選擇性富集效果,說明免疫反應(yīng)體系在分離富集過程的利用可以大大減少其他真菌毒素的干擾,實現(xiàn)目標物的準確檢測。

為評價Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料在復(fù)雜谷物基質(zhì)中的應(yīng)用和重復(fù)使用性能,在5 g小麥樣品提取液中分別加入0.1、0.5、1.0 ng/mLAFB1標準溶液,分離富集后,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定洗滌液中的AFB1含量,重復(fù)5次。結(jié)果表明,該材料在復(fù)雜樣品中依然保持優(yōu)異的富集能力,回收率為81.34%～89.96% (見表1),并且經(jīng)多次使用后的Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料對AFB1的回收率變化不大,RSD≤4.96%,說明材料的重復(fù)使用性能良好。因此,Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料具有較好的分離富集能力和顯著的特異性,在復(fù)雜的谷物基質(zhì)中也有令人滿意的表現(xiàn)。

2.4.2儲存性能驗證

為驗證Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料在4 ℃條件下的儲存期限,分別在第1、3、5、7、9、11 d按照1.4節(jié)所述步驟對1 mL AFB1標準溶液(10 μg/mL,溶于pH=7.4的PBS)進行分離富集,探究儲存不同天數(shù)后材料對AFB1的富集效果變化。最后采用1 mL PBS溶液(pH=8.0)對材料進行洗滌,從而保持材料表面抗體活性以供下次測定。如圖7顯示,第1～7 d內(nèi),材料的回收率有輕微波動,吸附效果整體處于較為穩(wěn)定的水平,而在第9 d和11 d均出現(xiàn)明顯的降低趨勢,推測是Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料偶聯(lián)的抗體活性隨著時間的延長逐漸下降。因此,該材料可在至少7 d內(nèi)保持良好的富集效果。

表 1 Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料在小麥樣品中的回收率和重復(fù)使用性

圖 7 不同保存天數(shù)下Ab-SiO2@Fe3O4磁性納米材料對AFB1的回收率(n=3)Fig. 7 Recoveries of AFB1 by Ab-SiO2@Fe3O4 magnetic nanomaterials under different storage days (n=3)

圖 8 不同體積比的乙腈-水-甲酸對谷物中AFB1提取效率的影響Fig. 8 Effects of different volume ratios of acetonitrile- water-formic acid on the extraction efficiency of AFB1 from grains

2.5 谷物中AFB1的提取條件優(yōu)化

在現(xiàn)有文獻報道的基礎(chǔ)上,研究了提取溶劑比例和提取條件對提取效果的影響[22,23]。本實驗考察了不同比例的乙腈-水-甲酸對AFB1提取率的影響,通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對添加AFB1標準品5 ng后的空白樣品中提取出的AFB1進行定量檢測來確定提取率。由圖8可知,一定量的水可以促進AFB1在實際樣品中的提取,而隨著水的比例逐漸升高,提取液的提取效果逐漸減弱,推測是過量的水對甲酸產(chǎn)生了稀釋作用,從而降低了甲酸對真菌毒素萃取效率的正向影響。另外,對比了顛倒混勻和超聲兩種方式的提取效果,顛倒混勻方法對谷物中AFB1的提取率為56.80%,而超聲方法的提取率為92.63%,因此后續(xù)采用乙腈-水-甲酸(85∶10∶5, v/v/v)溶液作為提取劑,超聲10 min的條件對樣品中的AFB1進行提取。

2.6 方法評價

2.6.1線性范圍和檢出限

將一定濃度梯度的標準AFB1溶液(0.1、1、2、5、10、20、40、50、60 μg/L)加入空白大米樣品中,分離富集后進入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以峰面積(Y)為縱坐標,AFB1的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標進行線性回歸分析,AFB1在2～50 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)=0.999。信噪比(S/N)分別為3和10時確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.04 μg/kg和0.13 μg/kg,遠低于國家標準中規(guī)定的10 μg/kg;而采用國標GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法在同樣條件下的檢出限和定量限分別為0.038 μg/kg和0.145 μg/kg,說明本方法提出的基于SiO2@Fe3O4的磁分離富集過程結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以達到與標準方法相當?shù)臋z測效果,且前處理方法更加簡單高效,可滿足實際樣品中痕量檢測的需求。

2.6.2回收率和精密度

為驗證該方法在復(fù)雜谷物基質(zhì)中檢測的準確性和可靠性,選取3種常見谷物(大米、玉米和小麥)的空白樣品,加入不同濃度的AFB1標準溶液,經(jīng)1.3節(jié)提取和1.4節(jié)分離富集步驟后進樣檢測,計算加標回收率,每種水平重復(fù)測定5次。結(jié)果如表2所示,該方法的回收率范圍為76.21%～92.85%, RSD≤5.29%。

表 2 AFB1在3種谷物基質(zhì)中4個水平下的加標回收率(n=5)

2.6.3實際樣品測定

從超市隨機購買30份谷物樣品,包含大米、玉米和小麥各10份,按照所建立的方法對該30份實際谷物樣品中的AFB1進行檢測。結(jié)果顯示,在1個小麥樣品和2個玉米樣品中檢出了AFB1,含量分別為0.38、0.13、0.47 μg/kg,均未超過國家標準所規(guī)定的限量指標,其余樣品均未檢出AFB1。采用GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法對上述陽性樣品中的AFB1含量進行復(fù)測,測得AFB1的含量分別為0.37、0.11、0.48 μg/kg,說明該方法具有較好的準確性。

基于SiO2@Fe3O4的磁分離富集過程結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與GB 5009.22-2016第三法高效液相色譜-柱后衍生法相比,優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面:一是檢測快速,免疫親和柱的凈化過程需要2.5 h以上,而基于Ab-SiO2@Fe3O4的分離富集過程在30 min內(nèi)即可快速完成,可節(jié)省80%以上的時間;二是操作簡單方便,利用材料的磁性可以與復(fù)雜基質(zhì)快速分離,無需多次洗脫和其他繁雜操作;三是成本較低,Ab-SiO2@Fe3O4的合成原料成本低,合成條件較為溫和,且對AFB1具有較強的特異性吸附能力,可達到良好的分離富集效果,而免疫親和柱價格昂貴,難以滿足大批量樣品的檢測需求;四是結(jié)果更加準確,采用Ab-SiO2@Fe3O4不僅可以達到較高的富集效率,實現(xiàn)更加充分的富集過程,且與HPLC-MS/MS結(jié)合可以達到較高的準確性,可實現(xiàn)谷物樣品中痕量AFB1的高效分析。

3 結(jié)論

本文采用微波輔助水熱法合成了Fe3O4磁性納米顆粒,進一步合成了Ab-SiO2@Fe3O4,采用該材料對3種谷物樣品中的AFB1進行分離富集,結(jié)合HPLC-MS/MS定量檢測,建立了一種高效檢測AFB1的方法。該方法將基于免疫反應(yīng)的高效分離富集材料Ab-SiO2@Fe3O4與靈敏度高的HPLC-MS/MS結(jié)合起來,線性關(guān)系、檢出限和重復(fù)性等方法學(xué)指標均能滿足不同谷物中AFB1的實際測定,且材料合成過程簡單、成本低廉,前處理過程簡單快速,檢測過程高效準確,可滿足大批量檢測要求,對于谷物安全監(jiān)管、真菌毒素風(fēng)險評估和守護人類健康具有重要意義。