李 慧, 任耿標(biāo), 李慧娟, 陳相峰, 張志國(guó), 趙燕芳*

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250353;2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院), 山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014)

雌激素是一種重要的內(nèi)分泌干擾化合物[1-3],與人類(lèi)身體器官的癌變有很大的關(guān)系,如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等[4-7]。近年來(lái),在環(huán)境水體、表層沉積物和牛奶中均檢測(cè)到了雌激素[8-11],蜂蜜中的雌激素可能來(lái)自于環(huán)境污染和人工添加[12,13]。根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)和歐洲食品安全管理局(European Food Safety Authority, EFSA)的規(guī)定,蜂蜜中禁止添加雌激素[14]。蜂蜜中的雌激素含量通常較低,檢測(cè)時(shí)會(huì)伴有許多干擾物質(zhì)。但是目前國(guó)內(nèi)并沒(méi)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,所以需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的檢測(cè)方法,以應(yīng)對(duì)蜂蜜樣品中痕量雌激素的檢測(cè)需求。

目前雌激素常用的分析方法有液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[15-18]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19-21]。樣品在色譜或質(zhì)譜分析之前,需要富集目標(biāo)物。各種預(yù)處理方法中,固相萃取(SPE)技術(shù)具有重現(xiàn)性好、回收率高、萃取時(shí)間短、有機(jī)溶劑消耗量低等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是雌激素樣品預(yù)處理的有效技術(shù)[22]。利用聚苯乙烯-二乙烯基苯(HLB)吸附劑萃取蜂蜜中雌激素時(shí),其他雜質(zhì)成分可能會(huì)吸附在HLB吸附劑上,干擾雌激素的富集[18]。這些干擾物的共吸附不僅影響雌激素的保留,還會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。因此,通常需要前處理程序來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng),提高方法精度。共價(jià)有機(jī)骨架材料(covalent organic framework materials, COF)是一種新型多孔材料,由輕質(zhì)元素組成,通過(guò)強(qiáng)共價(jià)鍵與有機(jī)單體連接[22,23]。因?yàn)镃OF具有大的負(fù)載容量、可調(diào)節(jié)的孔徑、高比表面積、高熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[24,25]等優(yōu)點(diǎn),所以被廣泛應(yīng)用于固相萃取技術(shù)。

在本研究中,我們制備了以亞胺連接的多孔共價(jià)有機(jī)骨架材料(imine-linked porous covalent organic framework material, IL-COF-1),作為SPE的吸附劑,用來(lái)富集蜂蜜中的雌激素。采用單因素優(yōu)化法對(duì)固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化,提出了一種用于蜂蜜中雌激素定量檢測(cè)的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-HPLC-MS/MS)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

SWPRATM55掃描電子顯微鏡(德國(guó)蔡司公司), Nicolet710傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)尼高力公司), Empyrean銳影X射線衍射儀(XRD, 荷蘭PANAlytical B. V.公司), ASAP 2020型比表面積測(cè)定儀(美國(guó)Micromeritics公司), JEM-7500型透射電子顯微鏡(TEM),高速離心機(jī)(Heraeus Multifuge X1R,美國(guó)賽默飛公司),液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX Triple Quad TM 5500,美國(guó)AB SCIEX公司)。

1,3,6,8-四(4-甲苯基)芘(TFPPy)、對(duì)苯二胺(p-PDA)、1,2-二氯苯、1-丁醇、乙酸購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國(guó)上海);雌酮(E1)、己烯雌酚(DES)、雌三醇(E3)、β-雌二醇(E2)、炔雌醇(EE2)購(gòu)于TCI (日本東京);甲醇、乙腈、丙酮均為HPLC級(jí),購(gòu)于默克有限公司(德國(guó));空柱管、篩板購(gòu)于Biocomma Limited (中國(guó)深圳);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 樣品制備及溶液配制

1.2.1樣品制備

蜂蜜樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)亓闶凼袌?chǎng),首先用20 mL超純水稀釋1 g蜂蜜于離心管內(nèi),然后渦旋2 min。使用0.45 μm微孔濾膜(水系,尼龍)過(guò)濾,備用。

1.2.2溶液配制

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱(chēng)取適量雌激素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,配成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確移取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,以甲醇定容,配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。4 ℃保存,使用時(shí)稀釋成所需濃度。

1.3 材料及固相萃取裝置的制備

1.3.1材料制備

IL-COF-1樣品是依據(jù)文獻(xiàn)[25]方法合成的。準(zhǔn)確稱(chēng)取TFPPy (80 mg, 0.128 mmol)與p-PDA (28 mg, 0.256 mmol)固體粉末置于Pyrex管中,然后加入1,2-二氯苯(2 mL)和1-丁醇(2.0 mL)。在室溫條件下超聲處理1 min,向溶液中添加0.4 mL的醋酸水溶液(6 mol/L)。隨后,將試管放入液氮浴中,快速冷凍、抽真空解凍,反復(fù)3次。然后將混合溶液升溫至120 ℃反應(yīng)72 h,自然冷卻至室溫,通過(guò)離心分離固體反應(yīng)產(chǎn)物,用甲醇洗滌,在60 ℃下真空干燥12 h,得到淺黃色固體粉末,即為IL-COF-1。IL-COF-1的元素分析結(jié)果:C, 87.39%; N, 7.84%; H, 4.76%。

1.3.2固相萃取裝置的制備

將30 mg IL-COF-1填入已放入墊片的SPE空柱管(體積3 mL)中,鋪平,將另一片墊片輕壓在材料上,組裝SPE柱。將組裝好的SPE柱放置在固相萃取裝置上,裝置的一端與真空泵連接,另一端與采樣器連接,采樣器的末端插入水樣中,用于抽取實(shí)際稀釋的蜂蜜樣品。

使用前用2 mL甲醇、超純水對(duì)SPE柱進(jìn)行活化;然后上樣,20 mL實(shí)際蜂蜜樣品(調(diào)節(jié)溶液pH=7)以3 mL/min的速度通過(guò)SPE柱;上樣后用5 mL超純水淋洗吸附在SPE柱上的雜質(zhì);常壓干燥5 min,用5 mL 1%(v/v)氨水-甲醇溶液洗脫。洗脫液氮吹至干,殘?jiān)? mL甲醇溶解,渦旋混勻30 s后,過(guò)0.22 μm微孔濾膜(有機(jī)系統(tǒng),尼龍),用HPLC-MS/MS分析。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜條件 Thermo Fisher Scientific C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm);流動(dòng)相A為乙腈,B為5 mmol/L的乙酸銨;等度洗脫:0～5 min, 45%A和55%B。柱溫40 ℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度10 ℃。

質(zhì)譜條件 電離方式:ESI-;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;氣簾氣壓力:275 kPa (40 psi);噴霧電壓:5.5 kV;離子源溫度:500 ℃;霧化氣壓力:345 kPa (50 psi);碰撞氣、霧化氣:N2。外標(biāo)法定量,其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 雌激素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式參數(shù)

2 結(jié)果和討論

2.1 IL-COF-1的表征

如圖1a所示,掃描電子顯微鏡圖像顯示IL-COF-1呈均勻的珊瑚狀形態(tài),具有約30～70 nm的聚集立方體形貌,與透射電子顯微鏡圖像顯示的IL-COF-1形態(tài)一致(見(jiàn)圖1b)。XRD圖譜顯示了IL-COF-1的晶體結(jié)構(gòu),觀察到5個(gè)衍射峰分別在(110)、(020)、(220)、(130)和(330)處,與文獻(xiàn)[25]數(shù)據(jù)一致(見(jiàn)圖1c)。IL-COF-1的BET比表面積為2 023 m2/g(見(jiàn)圖1d)?？讖郊s為3 nm (見(jiàn)圖1e)。傅里葉紅外光譜(FT-IR)如圖1f所示,1 621 cm-1處的峰顯示特征C=N鍵。光譜中還觀察到C=O (1 623 cm-1)和N-H (1 603 cm-1)振動(dòng),這驗(yàn)證了IL-COF-1表面存在醛和胺官能團(tuán)化的單體,有利于雌激素和IL-COF-1之間發(fā)生分子間O-H…N=C氫鍵相互作用。

圖 1 IL-COF-1材料的表征Fig. 1 Characterization of imine-linked porous covalent organic framework material (IL-COF-1) a. SEM image; b. TEM image; c. X-ray diffraction (XRD) patterns; d. nitrogen adsorption/desorption isotherms; e. pore size distribution curves; f. FT-IR spectrum.

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

對(duì)IL-COF-1吸附劑的吸附能力進(jìn)行驗(yàn)證。以E1、E2、E3、EE2和EDS 5種雌激素作為目標(biāo)物,E3、E2和EE2的含量為10 ng/g, E1和DES的含量為1.0 ng/g,利用這些化合物的回收率評(píng)價(jià)IL-COF-1對(duì)雌激素的萃取效果。為了獲取最優(yōu)的固相萃取條件,優(yōu)化了IL-COF-1的用量、樣品溶液pH、樣品流速、洗脫液體積、洗脫液流速、樣品溶液中NaCl的含量及洗脫液類(lèi)型。

考察了20～40 mg IL-COF-1用量對(duì)樣品回收率的影響(見(jiàn)圖2a)。結(jié)果表明,使用30 mg吸附劑的回收率最高。因此,實(shí)驗(yàn)中使用30 mg IL-COF-1作為固相萃取填料。IL-COF-1的用量與其高比表面積密切相關(guān)。

圖 2 (a) IL-COF-1的量、(b)樣品pH、(c)樣品流速、(d)洗脫液體積、(e)洗脫液流速和(f) NaCl濃度對(duì)雌激素萃取效率的影響(n=6)Fig. 2 Effects of (a) IL-COF-1 amount, (b) sample pH, (c) sample flow rate, (d) eluent volume, (e) flow rate of eluent, and (f) NaCl concentration on estrogen extraction efficiency (n=6)

樣品pH值是影響雌激素回收率的重要因素之一,與樣品溶液中目標(biāo)物的存在狀態(tài)有關(guān)。選取樣品pH值范圍為3～8,如圖2b所示,在pH=7時(shí),5種雌激素的回收率最高?？赡苁且?yàn)榇萍に睾虸L-COF-1之間的相互作用主要有π-π相互作用和疏水相互作用。IL-COF-1與目標(biāo)物之間的作用力與目標(biāo)物的狀態(tài)有關(guān),不同的狀態(tài)可能產(chǎn)生不同的作用力。在pH=7時(shí),化合物以分子狀態(tài)為主,IL-COF-1與目標(biāo)物之間的作用力最強(qiáng)。因此,選擇pH=7。

樣品流速是影響目標(biāo)物質(zhì)滯留時(shí)間和預(yù)處理時(shí)間的主要因素,考察了樣品流速在1～5 mL/min 范圍內(nèi)的萃取效果。在1～3 mL/min范圍內(nèi),隨著樣品流速增大,回收率增大,一直保持在80%以上(見(jiàn)圖2c)。3～5 mL/min范圍內(nèi),回收率隨樣品流速增加而下降。因此,采用3 mL/min作為適宜的樣品流速。

考察了洗脫液(1%(v/v)氨水-甲醇溶液)體積在2～8 mL范圍內(nèi)的萃取效果(見(jiàn)圖2d)。在2～5 mL范圍內(nèi),隨著洗脫液體積的增加,雌激素回收率逐漸升高。而洗脫液超過(guò)5 mL后回收率幾乎保持不變(見(jiàn)圖2d)。所以,實(shí)驗(yàn)中洗脫液體積選擇5 mL。

洗脫液流速顯著影響雌激素和IL-COF-1之間的接觸反應(yīng)時(shí)間。考察了洗脫液(1%(v/v)氨水-甲醇溶液)流速在0.2～1.0 mL/min范圍內(nèi)的萃取效果。在0.2、0.4 mL/min時(shí),回收率維持在85%以上(見(jiàn)圖2e)。0.4～1.0 mL/min范圍內(nèi),回收率隨洗脫液流速增加而下降。因此,選擇0.4 mL/min作為最佳洗脫液流速。

考察了NaCl對(duì)目標(biāo)物質(zhì)萃取效率的影響。將NaCl添加到20 mL的樣品溶液中,配制含不同濃度NaCl樣品溶液進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)。如圖2f所示,當(dāng)NaCl濃度在0～0.2 mmol/L范圍時(shí),回收率出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。0.2～0.5 mmol/L范圍時(shí)回收率下降速度增加。所以,在萃取過(guò)程中不添加NaCl。

在SPE過(guò)程中,洗脫液種類(lèi)是影響萃取效率的關(guān)鍵因素?？疾炝瞬煌?lèi)型的洗脫液,包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%(v/v)氨水-甲醇溶液、1%(v/v)氨水-乙腈溶液和1%(v/v)氨水-乙酸乙酯溶液對(duì)萃取效果的影響(見(jiàn)圖3)。當(dāng)使用1%(v/v)氨水-甲醇溶液作為洗脫液時(shí),5種目標(biāo)物質(zhì)的回收率最高。因此,選擇1%(v/v)氨水-甲醇溶液作為本實(shí)驗(yàn)的洗脫液。

圖 3 洗脫液種類(lèi)對(duì)雌激素萃取效率的影響(n=6)Fig. 3 Effect of eluent type on estrogen extraction efficiency (n=6) 1. methanol; 2. acetonitrile; 3. ethyl acetate; 4. 1% (v/v) NH3·H2O-methanol; 5. 1% (v/v) NH3·H2O-acetonitrile; 6. 1% (v/v) NH3·H2O-ethyl acetate.

綜上,5種雌激素的最佳萃取條件為:IL-COF-1用量為30 mg, 1%(v/v)氨水-甲醇溶液作為洗脫液,洗脫液體積為5 mL,洗脫液流速為0.4 mL/min,樣品流速為3 mL/min,樣品pH=7,萃取過(guò)程中不添加NaCl。

2.3 IL-COF-1的穩(wěn)定性和重復(fù)性

以E1、E2、E3、EE2和EDS 5種雌激素作為目標(biāo)物,E3、E2和EE2的含量為10 ng/g, E1和DES的含量為1.0 ng/g。利用回收率評(píng)價(jià)IL-COF-1的重復(fù)性和穩(wěn)定性,采用最佳萃取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

IL-COF-1的制備重復(fù)性 以6個(gè)批次制備的IL-COF-1作為固相萃取柱的填料,不同批次間目標(biāo)物回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.2%～9.1%,表明IL-COF-1具有較好的制備重復(fù)性。

IL-COF-1的可重復(fù)使用性 對(duì)同一根固相萃取柱連續(xù)使用6次后,目標(biāo)物回收率的RSD為2.5%～6.1%,表明IL-COF-1具有較好的可重復(fù)使用性。

IL-COF-1的穩(wěn)定性 使用同一根IL-COF-1固相萃取柱在6天內(nèi)(每天試驗(yàn)一次)獲得的雌激素回收率為95.1%～107.4%, RSD值為6.2%～8.9%,表明其穩(wěn)定性較好。

2.4 方法驗(yàn)證

分別吸取不同體積的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液,加入到20 mL(含1 g蜂蜜)的水溶液中,得到含E3、E2和EE21、10、25、50、100、250和500 ng/g以及E1和DES 0.1、0.5、1、10、25、50、100 ng/g的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,檢測(cè),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在最優(yōu)條件下,如表2所示,該方法對(duì)E3、E2和EE2的線性范圍為1～500 ng/g,對(duì)E1和DES的線性范圍分別為0.1～100 ng/g,相關(guān)系數(shù)(r)為0.993 4～0.997 2。檢出限(LOD,S/N=3)為0.01～0.30 ng/g,定量限(LOQ,S/N=10)為0.05～0.95 ng/g。

對(duì)含量為50 ng/g的5種雌激素進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn),日內(nèi)精密度RSD為3.2%～6.6%,日間精密度RSD為4.2%～7.9%。

這些結(jié)果表明,基于IL-COF-1的SPE方法具有較高的靈敏度、良好的線性關(guān)系和較好的重復(fù)性。IL-COF-1材料作為SPE的吸附劑,可以用于蜂蜜樣品中5種雌激素的檢測(cè)。

2.5 方法應(yīng)用

使用所開(kāi)發(fā)的SPE-HPLC-MS/MS方法測(cè)定蜂蜜樣品中的雌激素,2種蜂蜜樣品中均未檢測(cè)到5種雌激素。為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性,進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3和圖4。3個(gè)加標(biāo)水平(5、25、50 ng/g)下的回收率為80.14%～115.24%。以上結(jié)果表明,IL-COF-1作為吸附劑能很好地用于蜂蜜中雌激素的萃取。

在固相萃取過(guò)程中,IL-COF-1和雌激素之間可能存在如下相互作用:(i) IL-COF-1和雌激素中的芳香單元有利于形成π-π相互作用[26]; (ii)考慮到N和O等電負(fù)性原子的存在,雌激素和IL-COF-1之間也可能發(fā)生分子間O-H…N=C氫鍵相互作用[27]; (iii) IL-COF-1的高比表面積通過(guò)上述相互作用可增強(qiáng)雌激素與IL-COF-1的接觸;(iv)孔徑效應(yīng)會(huì)阻止樣品中大分子的通過(guò),促進(jìn)萃取過(guò)程中目標(biāo)分析物的吸附和解吸。

表 2 SPE-HPLC-MS/MS方法分析性能

表 3 蜂蜜樣品中5種雌激素的加標(biāo)回收率(n=5)

圖 4 (a)空白蜂蜜樣品、加標(biāo)(b)5 ng/g和(c)25 ng/g雌激素的蜂蜜樣品的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of (a) a blank honey sample and blank honey sample spiked with (b) 5 ng/g and (c) 25 ng/g estrogens

3 結(jié)論

以IL-COF-1作為吸附劑,基于SPE技術(shù)和HPLC-MS/MS,建立了一種高效、靈敏的分析蜂蜜樣品中痕量雌激素的新方法。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本方法具有較低的檢出限和較寬的線性范圍,穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。將本方法應(yīng)用于實(shí)際蜂蜜樣品分析,取得了滿(mǎn)意的結(jié)果。IL-COF-1在雌激素的固相萃取中表現(xiàn)出優(yōu)越的性能,需要進(jìn)一步探索IL-COF-1在痕量分析中的應(yīng)用。