李洪艷, 楊 歡, 馬晨怡, 張琬悅, 徐清宇, 陳銘學(xué), 馬有寧

(中國水稻研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心, 浙江 杭州 310006)

稻米被譽為“天然營養(yǎng)素包”之一,富含人體所需的各種營養(yǎng)素及生理活性物質(zhì),如纖維素、礦物質(zhì)、脂肪、谷維素和維生素E等[1,2]。谷維素大約在60年前首次在稻米中被發(fā)現(xiàn),它是植物甾醇或三萜醇的阿魏酯混合物[3,4],稻米中約85%的谷維素主要由3種化合物組成,分別是24-亞甲基環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯(24MCA-FA)、環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯(CA-FA)和菜油甾醇阿魏酸酯(Camp-FA)[5]。谷維素由于表現(xiàn)出較強的生物活性使得其在化妝品行業(yè)、營養(yǎng)和藥物領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力[6],如治療高血壓、消除臉部黑色素沉積、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)等作用[7-9]。

現(xiàn)今谷維素類化合物的提取及測定主要集中在稻米米糠油方面的研究,而對稻米籽粒中谷維素類化合物的提取及測定的研究較少。因此,測定稻米中3種谷維素含量的方法研究,對于稻米制品以及稻米中谷維素類化合物的應(yīng)用具有重要意義。

目前谷維素檢測方法主要為紫外分光光度法[10]、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11]等。其中紫外分光光度法操作簡便,但由于樣品中的雜質(zhì)會在檢測波長315 nm處出現(xiàn)較強吸收峰而導(dǎo)致測定結(jié)果偏高[12]; HPLC重復(fù)性高,但由于谷維素為混合物,HPLC很難測定單一的谷維素含量[13],如王英瑛等[14]利用HPLC測定谷維素片中的谷維素時發(fā)現(xiàn)所有谷維素組分均在同一時間出峰,不利于單一谷維素的定量分析;HPLC-MS/MS利用液相色譜的分離功能和質(zhì)譜的鑒定功能對樣品進行分離、分析和鑒定,能精確測定谷維素含量,如Waraksa等[15]采用HPLC-MS/MS技術(shù)實現(xiàn)了營養(yǎng)補充劑中CA-FA、Camp-FA、24MCA-FA以及β-谷甾醇阿魏酸酯(β-Sit-FA)4種谷維素的含量測定。提取方法有溶劑萃取法[16,17]、分子印跡法[18]和超聲輔助法[19]等。溶劑萃取法和分子印跡法操作時間較長,且溶劑萃取法所得谷維素純度不高;超聲輔助溶劑提取時可縮短實驗時間并且有助于谷維素提取效率的提高,如王玉瑩等[20]利用超聲輔助乙醇提取米糠油中的谷維素時,發(fā)現(xiàn)谷維素的提取效率相對于傳統(tǒng)溶劑提取法高14.31%左右。稻米樣品基質(zhì)復(fù)雜,含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、糖類等成分,對目標物容易造成干擾,因此上機前需要提取凈化[21]。常見的凈化方法有固相萃取、吸附法、液液萃取、膜富集法等。吸附法洗脫過程時間長,成品中也容易有溶劑殘留;膜富集法由于目標化合物和基質(zhì)中其他分子之間的大小差異太小,無法使用多孔膜實現(xiàn)進一步分離,所以只能實現(xiàn)目標化合物的初步富集[16];固相萃取法應(yīng)用最為廣泛,其發(fā)展與吸附劑的性能密切相關(guān),混合型固相萃取柱具有兩種不同色譜分離基質(zhì)(反相和離子交換),可以通過疏水性或離子作用實現(xiàn)選擇性保留,從而獲得更干凈的提取物。

為此本研究對稻米中3種谷維素CA-FA、24MCA-FA和Camp-FA提取條件和質(zhì)譜條件以及流動相種類等進行優(yōu)化后,再利用混合型陰離子交換固相萃取柱凈化樣品溶液以消除雜質(zhì)對目標物的干擾。綜上,本文建立了適用于稻米中3種谷維素的檢測方法,以期在實際樣品的檢測中得以應(yīng)用,并為進一步研究稻米中谷維素的變化規(guī)律和鑒別提供技術(shù)手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20ADCR液相色譜儀(Shimadzu,日本); AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(SCIEX,美國); KQ-300TED型高頻數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);十萬分之一天平(Mettler Toledo,美國); Milli-Q超純水儀(Millipore,美國); MS3 basic漩渦振蕩器、高速勻漿機(IKA,德國);氮吹儀(Organomation,美國); Primo R臺式離心機(Thermo Fisher Scientific,德國);Oasis MAX固相萃取柱(Waters,美國)。

甲醇、乙腈、異丙醇(色譜級)購于德國Merck公司;氨水、甲酸、乙酸銨(色譜級)購于美國Sigma-Aldrich公司;標準品:24MCA-FA購于中國北京百威靈科技有限公司(純度≥95%); CA-FA購于日本和光純藥株式會社(純度≥99.4%); Camp-FA購于加拿大Toronto Research Chemical公司(純度≥96%);實驗室用水為Milli-Q超純水。用于分析的稻米均由中國水稻研究所富陽基地種植所得。

1.2 標準溶液的配制

標準溶液的配制:用異丙醇配制Camp-FA質(zhì)量濃度為100.0 mg/L, CA-FA和24MCA-FA質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/L的標準儲備液,于-20 ℃保存。分別吸取一定量的標準儲備液,用甲醇配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/L的混合標準溶液,置于-20 ℃保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1超聲提取

稱取約2.5 g樣品于100.0 mL離心管中加入50.0 mL甲醇,1 000 r/min勻漿1 min,常溫條件下浸泡12 h,靜置完畢后在超聲溫度為40 ℃條件下超聲20 min,以4 500 r/min離心10 min,取10.0 mL上清液氮吹至近干,用30%甲醇水溶液(含1%氨水)定容至5.0 mL,待凈化。

1.3.2固相萃取柱凈化

將上述溶液轉(zhuǎn)移至依次用5.0 mL甲醇和5.0 mL 1%氨水溶液活化后的MAX固相萃取柱,再分別用5.0 mL 1%氨水溶液和5.0 mL甲醇淋洗,最后用5.0 mL含4%甲酸的甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,并用甲醇定容至10.0 mL,取上清液,過0.22 μm有機濾膜,濾液供HPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C8(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm),流動相A為5 mmol/L乙酸銨,流動相B為甲醇∶乙腈=1∶1(v/v);流速:0.35 mL/min;柱溫:45 ℃;進樣量:2.0 μL。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 20%B～95%B; 3.0～14.0 min, 95%B; 14.0～14.1 min, 95%B～20%B; 14.1～20.0 min, 20%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

電離模式:電噴霧電離、負離子模式(ESI-);氣簾氣壓力(CUR): 210 kPa;噴霧電壓(IS): -4 500 V;離子源溫度(TEM): 450 ℃;霧化氣壓力(GS1): 310 kPa;輔助加熱氣壓力(GS2): 240 kPa。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集,Analyst 1.6.3軟件系統(tǒng)處理數(shù)據(jù),相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)及離子信息見表1。

表 1 3種谷維素在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

谷維素是弱極性化合物,且Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱由硅膠鍵合辛烷基形成固定相,辛烷基極性大于十八烷基,且小于酰胺基團,因此更適用于分析弱極性化合物,故選擇Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱作為3種谷維素的分離柱。谷維素在甲醇、乙腈中均有良好的溶解性,所以選取甲醇和乙腈作為流動相B探討3種谷維素分離度及色譜峰的變化。如圖1a所示,當(dāng)流動相B為乙腈時,色譜峰表現(xiàn)出較明顯的劈叉、峰寬展寬以及不對稱現(xiàn)象,且24MCA-FA色譜峰不明顯;如圖1b可知,當(dāng)流動相B為甲醇時,色譜峰劈叉現(xiàn)象有所改善,峰形對稱且尖銳,且3種谷維素均出現(xiàn)明顯色譜峰。根據(jù)Camp-FA和CA-FA在乙腈中分離度為Rs=1.05、Camp-FA和24MCA-FA在甲醇中的Rs=1.18可知,單獨選擇一種溶劑作為流動相B不能有效地分離3種谷維素,因此嘗試將甲醇和乙腈按一定比例混合。如圖1c所示,當(dāng)甲醇和乙腈以體積比1∶1混合作為流動相B時,3種谷維素相鄰色譜峰之間的分離度分別為Rs1=1.21、Rs2=1.29,表明3種谷維素實現(xiàn)基本分離,故選擇甲醇∶乙腈=1∶1(v/v)為流動相B。

圖 1 不同流動相B對3種谷維素分離度及色譜峰的影響Fig. 1 Influence of different mobile phase B on the resolutions and chromatographic peaks for the three oryzanol a. acetonitrile; b. methanol; c. methanol∶ acetonitrile=1∶1 (v/v).

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取條件的優(yōu)化

Kumar等[22]采用超聲結(jié)合甲醇提取米糠中3種谷維素時,可獲得較好的提取效果,但缺乏對提取效率影響因素的系統(tǒng)探討。因此,設(shè)計5因素4水平L16(45)的正交實驗考察各因素對谷維素提取效率的影響。稱取2.5 g樣品,分別在不同料液比(即樣品質(zhì)量與提取液的體積比, g/mL)(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取液(85%、90%、95%、100%甲醇)、浸泡時間(6、9、12、15 h)、超聲溫度(35、40、45、50 ℃)和超聲時間(20、30、40、50 min)的條件下提取。

由表2極差R的大小可知,各因素對3種谷維素提取效率的影響依次為:提取液甲醇體積分數(shù)>浸泡時間>料液比>超聲時間>超聲溫度。以3種谷維素提取效率作為參考指標,5個因素的最優(yōu)提取組合為料液比1∶20 (g/mL)、甲醇體積分數(shù)100%、浸泡時間12 h、超聲溫度40 ℃以及超聲時間20 min。

表 2 正交實驗結(jié)果

圖 2 不同甲醇體積分數(shù)的上樣溶劑對3種谷維素穿透率的影響(n=3)Fig. 2 Influence of loading solvents with different volume fractions of methanol on the penetrability rates of the three oryzanols (n=3)

2.2.2凈化條件的優(yōu)化

MAX萃取柱適合分離純化弱酸性化合物,鑒于谷維素弱酸、弱極性的特點,采用MAX萃取柱凈化提取液。首先用5.0 mL甲醇和1%氨水活化MAX萃取柱,以30%、40%、50%、80%甲醇水溶液(含1%氨水)作為上樣溶劑分別配制5.0 mL質(zhì)量濃度為100 μg/L的混合標準溶液上樣,通過3種谷維素的穿透率,考察甲醇體積分數(shù)對3種谷維素在MAX萃取柱穿透率的影響。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)上樣液為30%甲醇水溶液(含1%氨水)時,3種谷維素穿透率均<1%,隨著甲醇體積分數(shù)的增加,穿透率逐漸升高,為確保3種谷維素能完全吸附于MAX萃取柱,確定上樣溶劑為30%甲醇水溶液(含1%氨水)。

同時為保證3種谷維素能被完全洗脫,考察含1%、2%、4%、5%甲酸的甲醇洗脫液對回收率的影響。由圖3結(jié)果表明,3種谷維素的回收率隨著甲酸體積分數(shù)的增加表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢,當(dāng)甲酸體積分數(shù)為4%時,3種谷維素幾乎被完全洗脫,回收率為95.5%～100.4%。因此選用含4%甲酸的甲醇為洗脫液。

圖 3 不同甲酸體積分數(shù)的洗脫液對3種谷維素回收率的影響(n=3)Fig. 3 Influence of eluents with different volume fractions of formic acid on the recoveries of the three oryzanols (n=3)

表 3 3種谷維素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指在樣品測定過程中,由于待測物以外其他物質(zhì)的存在或其他物理、化學(xué)因素直接或間接影響離子化效果,從而影響待測物響應(yīng)強度的現(xiàn)象[23]。本實驗采用1.3節(jié)前處理方法分別制備未凈化的樣品溶液和凈化后的樣品溶液,分別以甲醇、未凈化的樣品溶液和凈化后的樣品溶液為溶劑,配制溶劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線,通過公式ME=(基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%計算3種谷維素的基質(zhì)效應(yīng),以評價基質(zhì)中雜質(zhì)對分析物的影響[24]。由圖4可知,未凈化前CA-FA的ME為53.1%表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng),24MCA-FA的ME為-22.0%表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);凈化后,3種谷維素ME為1.6%～10.8%,樣品的基質(zhì)效應(yīng)減弱,表明樣品基質(zhì)對分析物的影響較小。

圖 4 稻米中3種谷維素在凈化前、后的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Matrix effects of the three oryzanols in rice before and after the purification

2.4 標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

將3種谷維素配制成系列濃度的標準工作液,以待測物峰面積為縱坐標,質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果如表3所示,Camp-FA、CA-FA在1.0～500.0 μg/L和24MCA-FA在5.0～1 000.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均≥0.998 3。以3種谷維素定量離子色譜峰的信噪比(S/N)為3和10計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果表明,3種谷維素的LOD為0.5～1.0 μg/L, LOQ為2.0～3.5 μg/L。

表 4 稻米中3種谷維素的加標回收率及精密度(n=3)

2.5 加標回收率和相對標準偏差

谷維素在稻米中本底含量相對較高,為進一步驗證該方法測定稻米中3種谷維素的可行性,所以選擇3種谷維素本底含量較少的稻米品種(揚粳722)進行加標回收試驗。加標水平為稻米中3種谷維素本底含量的2、5和10倍,經(jīng)1.3節(jié)步驟前處理,每個水平重復(fù)測定3次。由表4結(jié)果可知,3種谷維素的平均回收率為86.1%～110.6%,相對標準偏差為0.9%～3.2%,表明本方法具有良好的準確度和精密度。

2.6 在實際樣品分析中的應(yīng)用

為了驗證本研究建立方法的適用性,實驗最后采用建立的分析方法測定不同稻米中3種谷維素的含量,分析結(jié)果見表5。在7份稻米樣品中均檢測到3種谷維素,其含量為1.68～42.51 mg/kg。因此,該方法對稻米中谷維素類化合物含量的測定具有參考作用。

表 5 實際樣品中3種谷維素的含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合混合型陰離子交換固相萃取柱測定稻米中3種谷維素的分析方法。對前處理方法與色譜條件進行了優(yōu)化,并進行了系列方法學(xué)驗證。該方法具有操作簡單、重復(fù)性強等特點,適合批量、快速檢測稻米樣品中3種谷維素的含量,并對谷維素類化合物的檢測及應(yīng)用具有一定參考價值。