王曉芳，馮靖

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，天津 300052；2.天津市職業(yè)病防治院綜合內(nèi)科，天津 300011）

感染在惡性血液病患者治療過(guò)程中較常見(jiàn)[1]，是免疫功能低下患者死亡的主要原因，合理地使用抗菌藥物能夠改善患者預(yù)后[2]。惡性血液病患者由于接受腫瘤放化療、長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑導(dǎo)致免疫功能受到抑制，易同時(shí)感染多種病原菌，臨床往往僅表現(xiàn)為發(fā)熱，多數(shù)患者感染部位不明確。目前臨床常用的檢測(cè)方法包括病原體檢測(cè)（如血尿便、分泌物及肺泡灌洗液等標(biāo)本的培養(yǎng)）、炎癥指標(biāo)、影像學(xué)檢查等，臨床醫(yī)師可結(jié)合這些常用的檢測(cè)方法經(jīng)驗(yàn)性選擇抗菌藥物，但是這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性率低、特異性差，往往不能同時(shí)檢測(cè)出多種病原菌，特別是對(duì)于真菌、病毒以及特殊病原體的檢測(cè)，導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療往往只能覆蓋部分致病菌甚至未能覆蓋，延誤診治。且有部分免疫功能低下患者，同時(shí)并發(fā)細(xì)菌、真菌和病毒感染，增加了病原學(xué)診斷的難度。臨床上急需一項(xiàng)快速準(zhǔn)確的診斷方法。

宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是近年來(lái)快速發(fā)展的病原學(xué)診斷方法，能夠在單次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)100 萬(wàn)個(gè)以上堿基對(duì)的核酸序列，序列數(shù)可以與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，從而識(shí)別病原體[1-3]。能夠快速識(shí)別病原體，24～48 h內(nèi)可獲得結(jié)果[4]；并且可同時(shí)檢測(cè)多種病原體，提供病原菌物種、菌株、抗生素耐藥性，甚至毒力等特征。對(duì)于惡性血液病并發(fā)感染的患者而言，快速準(zhǔn)確地做出病原菌的診斷至關(guān)重要。因此本研究回顧性分析了mNGS 在惡性血液病并發(fā)感染患者中的臨床數(shù)據(jù)，提示mNGS 檢測(cè)聯(lián)合傳統(tǒng)的檢測(cè)方法可對(duì)臨床醫(yī)生合理應(yīng)用抗菌藥物提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019 年1 月—2020 年12 月就診于天津市第一中心醫(yī)院血液科的惡性血液病患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確診斷為惡性血液病。（2）長(zhǎng)期服用激素或其他免疫抑制劑或多次經(jīng)過(guò)腫瘤放化療導(dǎo)致免疫功能低下。（3）同時(shí)完善血培養(yǎng)和血漿mNGS。（4）發(fā)熱（體溫＞37.5℃）考慮可能為感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病史資料不全的患者。（2）標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果考慮為污染的患者。本研究已獲得天津市一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理要求。所有受試者均知情同意。

共納入患者190 例，其中男性132 例，女性58 例，中位年齡49（10～81）歲，常見(jiàn)基礎(chǔ)疾病分別為：急性髓系白血病77 例（40.53%）、急性淋巴細(xì)胞白血病48 例（25.26%）、淋巴瘤24 例（12.63%）、骨髓增生異常綜合征11 例（5.79%）、多發(fā)性骨髓瘤5 例（2.63%）、原發(fā)性骨髓纖維化4 例（2.11%）、其他21例（包括華氏巨球蛋白血癥、淀粉樣變性、Castleman 病等）。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本的收集及處理 于患者寒戰(zhàn)時(shí)或體溫峰值前半小時(shí)，同時(shí)采集血漿mNGS 和血培養(yǎng)。血培養(yǎng)樣本送往天津市第一中心醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)；mNGS 樣本在2 h 內(nèi)送往天津華大基因?qū)嶒?yàn)室，完善DNA 提取和文庫(kù)制備，應(yīng)用MGISEQ-2000 基因測(cè)序儀完成樣本中微生物核酸片段的序列測(cè)定，與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用來(lái)識(shí)別病原體。

1.2.2 mNGS 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) 所有mNGS 結(jié)果均在48 h內(nèi)回報(bào)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）細(xì)菌或病毒：覆蓋率比任何其他微生物高10 倍。（2）真菌：覆蓋率比任何其他真菌高5 倍。（3）在該處＞30%的相對(duì)豐度細(xì)菌、病毒或真菌中的屬水平。（4）結(jié)核分枝桿菌：由于DNA 提取困難和污染可能性低，至少有一個(gè)序列數(shù)[5]。

1.2.3 臨床診斷參考標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）[6]，依據(jù)患者臨床癥狀、體征、傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)結(jié)果以及對(duì)治療的反應(yīng)做出綜合診斷。抗感染有效定義為：患者使用抗菌藥物72 h 后體溫峰值下降0.5℃或7 d 后無(wú)發(fā)熱[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)所有納入的190 例患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，建立Excel 表格并分類錄入數(shù)據(jù)。頻數(shù)資料采用例數(shù)及百分比（保留兩位百分比）；應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)Pearson χ2檢驗(yàn)或McNemar 檢驗(yàn)對(duì)離散變量進(jìn)行比較分析，對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，采用t檢驗(yàn)，對(duì)于不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，應(yīng)用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS 結(jié)果分析 mNGS 檢測(cè)結(jié)果顯示共檢測(cè)出68 種病原微生物，其中細(xì)菌45.59%（31/68）、病毒26.47%（18/68）、真菌20.59%（14/68），其他為非典型病原體7.35%（5/68）。最常見(jiàn)的細(xì)菌、真菌、病毒分別為葡萄球菌、熱帶念珠菌和細(xì)環(huán)病毒。按照種屬分布，常見(jiàn)細(xì)菌、真菌、病毒的分布如圖1～3。此外根據(jù)mNGS 結(jié)果，同時(shí)檢出混合病原體的患者為35.79%（68/190），分別為細(xì)菌+病毒、細(xì)菌+真菌、病毒+真菌及細(xì)菌+病毒+真菌。

圖1 細(xì)菌菌屬分布Fig 1 Bacterial genus distribution

圖2 病毒種類的分布Fig 2 Distribution of virus species

圖3 真菌菌屬的分布Fig 3 Distribution of fungal genera

2.2 mNGS 與血培養(yǎng)陽(yáng)性率比較 190 例患者中mNGS 陽(yáng)性率為77.37%（147/190），血培養(yǎng)陽(yáng)性率為8.02%（13/190），mNGS 陽(yáng)性率顯著高于血培養(yǎng)（χ2=13.36，P＜0.01）。其中，mNGS 檢出細(xì)菌的陽(yáng)性率為46.80%（89/190），血培養(yǎng)檢出細(xì)菌陽(yáng)性率為92.30%（12/13），血培養(yǎng)檢出細(xì)菌陽(yáng)性率較mNGS 高（χ2=4.69，P＜0.05）；mNGS 在真菌檢測(cè)中陽(yáng)性率為24.74%（47/190），血培養(yǎng)陽(yáng)性率為7.70%（1/13），mNGS 檢出真菌的陽(yáng)性率高于血培養(yǎng)（χ2=3.84，P＜0.05）；病毒均在mNGS 中可檢測(cè)到。

2.3 mNGS 與血培養(yǎng)所需時(shí)間的比較 從實(shí)驗(yàn)室獲取標(biāo)本開(kāi)始直至結(jié)果的匯報(bào)，血培養(yǎng)所需要時(shí)間平均為（102.31±12.31）h，而mNGS 為（29.18±3.28）h，兩者之間存在顯著差異（t=22.37，P＜0.01）。

2.4 mNGS 診斷性能及其與血培養(yǎng)的一致性分析 根據(jù)臨床醫(yī)師的最終診斷，考慮為感染的患者數(shù)為162 例（85.26%），非感染患者數(shù)為17 例（8.95%），臨床尚未確定的患者數(shù)為11 例（5.79%）。血培養(yǎng)檢測(cè)到的致病菌在血mNGS 中均被檢測(cè)到。根據(jù)最終臨床診斷，mNGS 的敏感性為80.25%，特異性為47.06%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.53%，陰性預(yù)測(cè)值20%。血培養(yǎng)的敏感性為8.02%，特異性為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為10.24%。mNGS 敏感性高于血培養(yǎng)（χ2=10.83，P＜0.01），特異性低于血培養(yǎng)（χ2=8.21，P＜0.01）。

2.5 mNGS 與血培養(yǎng)檢測(cè)病原體分析 13 例mNGS 和血培養(yǎng)均為陽(yáng)性。分析兩種檢測(cè)方法的結(jié)果：1 例患者結(jié)果完全一致，為單核細(xì)胞李斯特菌。11 例患者結(jié)果部分一致，血培養(yǎng)及mNGS 培養(yǎng)均檢測(cè)到的病原體為：大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、人葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、熱帶念珠菌。mNGS 檢測(cè)到而血培養(yǎng)未檢測(cè)到的病原體主要涉及赤曲霉、人類皰疹病毒5 型（CMV）、JC 多瘤病毒、鬼傘屬、近平滑念珠菌、輪生鐮刀菌。1 例完全不一致，血mNGS為熱帶念珠菌，血培養(yǎng)為紋帶棒狀桿菌。

2.6 mNGS 檢測(cè)對(duì)臨床抗感染治療的影響 190 例患者在接受經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療后完善mNGS 結(jié)果，抗菌藥物覆蓋情況如圖4，部分患者抗病毒和抗真菌為預(yù)防用藥。根據(jù)mNGS 結(jié)果，75 例（46.30%）患者調(diào)整抗菌藥物使用后，評(píng)價(jià)有效率為49.30%。值得注意的是，87 例患者未根據(jù)血漿mNGS 的結(jié)果調(diào)整抗感染治療方案，考慮并非所有檢出病原體均為致病菌，61 例（37.65%）患者因經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物已經(jīng)覆蓋所檢測(cè)出的致病菌而未調(diào)整抗感染方案，26例（16.05%）患者考慮檢出病原體為非致病菌（如細(xì)環(huán)病毒等定植微生物），因而未調(diào)整抗菌藥物。

圖4 預(yù)防性抗生素覆蓋情況Fig 4 Prophylactic antibiotic coverage

3 討論

惡性血液病是骨髓、造血組織和淋巴組織發(fā)生的惡性腫瘤，如各類白血病、骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性腫瘤、漿細(xì)胞疾病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤等。此類疾病病情進(jìn)展迅速，死亡率高。早期規(guī)范放化療或行造血干細(xì)胞移植可延緩疾病進(jìn)展，部分患者甚至可達(dá)到完全緩解狀態(tài)。但與此同時(shí)，放化療出現(xiàn)骨髓抑制導(dǎo)致患者免疫功能低下增加感染風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致死亡率升高。因此早期對(duì)惡性血液病并發(fā)感染的患者進(jìn)行病原學(xué)診斷至關(guān)重要，可降低此類患者死亡率。因此本文對(duì)190 例惡性血液病患者進(jìn)行回顧性分析，血漿mNGS 的病原菌檢出率為77.37%。Shen 等[8]在國(guó)家兒童健康臨床研究中心兒童醫(yī)院血液科的發(fā)熱住院患者中統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)微生物檢測(cè)在7.14%的患者中發(fā)現(xiàn)致病微生物，當(dāng)常規(guī)檢測(cè)陰性時(shí)，mNGS 報(bào)告病原體檢測(cè)率為57.40%。筆者結(jié)果似乎較既往研究高，這可能有免疫功能低下患者容易受到感染及入組患者特征不同等因素的影響。細(xì)菌是190 例患者中檢出率最高的病原菌（49.2%），最常見(jiàn)的細(xì)菌、真菌、病毒分別為人葡萄球菌、熱帶念珠菌和細(xì)環(huán)病毒。

傳統(tǒng)的血培養(yǎng)陽(yáng)性率通常在10%左右[9]，免疫缺陷患者由于多種廣譜抗生素的使用，使血培養(yǎng)檢出率更低。本研究表明，mNGS 敏感性高于血培養(yǎng)（P＜0.001），但是特異性低于血培養(yǎng)（P=0.004），敏感性與既往研究報(bào)告中結(jié)果基本一致[10]。mNGS 特異性低，可能與其血漿樣本檢測(cè)的是游離核酸片段，可能是活病原生物基因組純化，也有可能是已經(jīng)死亡病原生物脫落的核酸碎片有關(guān)，因此導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與臨床預(yù)期不符。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法（包括血培養(yǎng)）很難同時(shí)檢測(cè)出多種病原體。而惡性血液病患者常常由于化療等原因?qū)е旅庖吖δ苋毕?，極易導(dǎo)致機(jī)會(huì)致病菌感染。本研究中，162 例考慮感染的患者中，有13 例血培養(yǎng)與mNGS 檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。其中1 例檢測(cè)到的病原體完全一致，為單核細(xì)胞李斯特菌。12 例部分一致，其余1 例完全不一致。兩種檢測(cè)方法部分一致匹配的病原體為大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、人葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、熱帶念珠菌。部分不一致和完全不一致的主要涉及病毒和部分真菌。結(jié)合患者病情特點(diǎn)考慮為混合病原體感染。根據(jù)藥敏結(jié)果加用抗生素的同時(shí)，依m(xù)NGS 檢測(cè)結(jié)果分別加用抗病毒和抗真菌治療，72 h 后患者未再發(fā)熱。190 例患者中mNGS 結(jié)果為多種病原體（細(xì)菌+病毒、病毒+真菌、細(xì)菌+真菌+病毒）的比例為35.79%。與免疫功能正常的患者相比，免疫功能低下患者中易發(fā)現(xiàn)更多的混合病原體[11]。文獻(xiàn)表明，mNGS 在診斷病毒方面的敏感性低于PCR，但它能夠檢出常規(guī)方法檢測(cè)不到的病毒[12]，且對(duì)細(xì)菌和真菌的陽(yáng)性率顯著高于血培養(yǎng)（P＜0.001）。同時(shí)mNGS 在（29.18±3.28）h 內(nèi)可診斷出病原體，而普通血培養(yǎng)往往長(zhǎng)達(dá)（102.31±12.31）h，檢測(cè)速度快是mNGS 的優(yōu)勢(shì)之一。對(duì)于惡性血液病并發(fā)感染患者，尤其化療后粒細(xì)胞缺乏感染部位不明確的人群，及早快速準(zhǔn)確的獲得病原體類型，對(duì)于降低患者死亡率至關(guān)重要。因此mNGS 可作為傳統(tǒng)檢測(cè)的一種有效補(bǔ)充手段，結(jié)合病原體檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)抗病原微生物藥物的選擇，從而優(yōu)化抗感染治療。

值得注意的是，根據(jù)血漿mNGS 結(jié)果，75 例（46.30%）患者的經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療未覆蓋或未完全覆蓋病原菌，經(jīng)過(guò)調(diào)整后，評(píng)價(jià)有效率為49.30%。其中51/101（50.50%）例根據(jù)血漿mNGS 結(jié)果調(diào)整抗菌藥物的使用，26/51 例患者經(jīng)過(guò)調(diào)整后評(píng)價(jià)有效率為50.99%。此外，惡性血液病并發(fā)感染患者由于免疫功能缺陷，經(jīng)常使用大量抗生素，不僅易導(dǎo)致耐藥，甚至可能影響患者的預(yù)后[13]。筆者根據(jù)mNGS結(jié)果對(duì)使用不恰當(dāng)?shù)目股亟导?jí)或停止，并且未產(chǎn)生不良預(yù)后。該結(jié)果與既往的研究一致[14]。因此，在經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物后，傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法受限制時(shí)，mNGS 可以幫助臨床醫(yī)生調(diào)整抗感染方案。

目前有文獻(xiàn)表明，肺泡灌洗液、肺組織、腦脊液、皮膚和軟組織等感染部位的mNGS 可用于病原菌的診斷，病原菌檢出率可達(dá)80%以上[14-20]。然而對(duì)于惡性血液病患者，部分不能耐受或者不能接受肺泡灌洗或者肺組織活檢等有創(chuàng)操作，血漿標(biāo)本相比而言更易獲得。惡性血液病并發(fā)感染患者臨床可能僅表現(xiàn)為發(fā)熱，多數(shù)沒(méi)有明確的感染灶，血漿mNGS與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如胸部CT、培養(yǎng)、PCR 等相結(jié)合，可使得病因?qū)W診斷更準(zhǔn)確。然而，尚不能確定血漿mNGS 陽(yáng)性是否可直接診斷為菌血癥或明確感染部位。

總之，本研究表明，mNGS 與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，能夠及時(shí)、準(zhǔn)確的幫助臨床醫(yī)師進(jìn)行病原學(xué)診斷，及時(shí)調(diào)整抗生素的使用，這對(duì)惡性血液腫瘤并發(fā)感染的患者至關(guān)重要。

但是本研究是有一定的局限性的，如樣本量較少，患者基礎(chǔ)疾病診斷種類較多。盡管NGS 在感染患者中已被廣泛接受和應(yīng)用，但敏感性較高，其結(jié)果易受到污染等因素的干擾，尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)修改或指導(dǎo)臨床治療策略，特別是對(duì)于一些疑難雜癥，限制了其在臨床研究中的應(yīng)用。盡管存在一些局限性，但本研究表明，mNGS 可以幫助臨床醫(yī)生迅速調(diào)整抗菌藥物，具有一定的臨床意義。