武燕潔，李譞媛，宣成昊，蘭蓓

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，天津 300070）

肝細胞癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]。盡管在臨床上肝癌的治療取得了很大進展，但由于術(shù)后腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，患者的整體預后較差[2-3]。既往研究表明，肝癌的進展涉及多因素誘因和基因突變[4-6]。因此，研究分析肝癌中異常表達的基因?qū)⒂兄谠谂R床上找到新的治療靶點。

Mediator of RNA polymerase Ⅱ transcription（Mediator）是一種多亞基復合體[7]，在轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶Ⅱ之間發(fā)揮橋梁作用，能夠在轉(zhuǎn)錄的多個階段調(diào)控基因表達，包括轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成、轉(zhuǎn)錄延長、增強子-啟動子環(huán)的形成等過程[8-9]。MED19（Mediator complex 19）是Mediator 復合體的主要成員，能夠與轉(zhuǎn)錄因子GATA 和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）結(jié)合進而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[10-11]。越來越多的研究表明，MED19 的異常表達與乳腺癌、胃癌、肺癌和膀胱癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12-15]，然而其在肝癌中的表達與功能尚未進行研究。筆者將基于TCGA 數(shù)據(jù)庫，分析MED19 的表達對肝癌診斷和預后的價值，以期為肝癌的臨床診斷治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及篩選 從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載肝癌的RNAFPKM（Fragments Per Kilobase per Million）表達數(shù)據(jù)和肝癌患者的臨床資料，數(shù)據(jù)包含371 例肝癌患者數(shù)據(jù)，其中50 例患者樣本包含正常肝臟組織和癌組織，剩余321 例樣本只包含癌組織。免疫組化數(shù)據(jù)分析來自HPA（Human Protein Atlas）數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）。

1.2 免疫分析 在免疫分型方面，根據(jù)6 個代表性免疫基因集：Wound healing（C1）、INF-gamma Dominant（C2）、Inflammatory（C3）、Lymphocyte Depleted（C4）、Immunologically Quiet（C5）、TGF-beta Dom inant（C6）的基因集富集分析（gene set variation analysis，GSVA）富集score，將腫瘤樣本分成6 種不同的免疫亞型，每個免疫亞型代表特定的免疫微環(huán)境。從UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）下載肝癌患者的免疫分型數(shù)據(jù)，比較MED19 表達在各個免疫亞型之間是否存在差異。在免疫評分方面，通過ESTIMATE 算法可以計算腫瘤樣本的腫瘤微環(huán)境的免疫分數(shù)和基質(zhì)分數(shù)，分值越大表明腫瘤微環(huán)境中免疫細胞或基質(zhì)細胞比例越大。從ESTIMATE:Home -Bioinformat ics（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/）中下載每個腫瘤樣本的免疫得分和基質(zhì)得分。以371 例肝癌組織樣本中MED19 表達中位數(shù)（MEDIA=4.40）為界，比較MED19 高表達組和低表達組的得分是否存在差別。

1.3 生存分析與臨床相關(guān)性分析 以樣本中MED19基因表達的中位數(shù)（MEDIA=4.40）為界，將MED19分為高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier 生存曲線分析及GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析MED19 基因表達與肝癌患者生存期的相關(guān)性。單因素和多因素Cox 回歸分析MED19 表達量及各個臨床參數(shù)與肝癌患者預后的關(guān)系并計算風險比（hazard ratio）。

1.4 GSEA 通過GSEA 分析在肝癌樣本中MED19 高表達組和低表達組的差異表達基因，探討MED19表達水平的差異對細胞信號通路的影響。本研究采用kegg.v7.4 數(shù)據(jù)集，按照缺省參照設置進行富集分析，選擇q＜0.05 為顯著富集的基因集。

1.5 差異基因分析及GO（Gene Ontology）與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析 采用樣本的RNAFPKM 值，通過R 語言“l(fā)imma 包”篩選MED19 高表達組和低表達組的差異基因，將表達上調(diào)與表達下調(diào)的基因分別在metascape（https://metascape.org/gp/index.html）進行GO 和KEGG富集分析。

1.6 MED19 表達量與藥物敏感性的相關(guān)性 使用Cellminer（https://discover.nci.nih.gov/SclcCellMiner-CDB/）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，篩選FDA approved 及Clinical trial數(shù)據(jù)，分析MED19 基因表達水平與藥物敏感性的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用R 語言R-4.0.3 軟件處理數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析。采用Wilcoxon 秩和檢驗比較MED19 在不同組織、不同臨床特征和免疫分型中的表達差異，比較MED19 高低表達組在免疫得分和基質(zhì)得分的差異。采用Kruskal-Wallis 檢驗分析MED19 表達在各個免疫亞型間的差異。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，通過Log-Rank 進行差異性檢驗比較生存時間差異，采用單因素和多因素Cox 風險模型進行分析，計算HR 和95%置信區(qū)間。采用Pearson 相關(guān)性分析計算MED19 表達與藥物敏感性的聯(lián)系。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MED19 在肝癌組織和正常組織中的表達差異分析 MED19 在肝癌組織和正常組織中的表達情況，分別繪制蜜蜂圖和箱式圖，結(jié)果顯示，腫瘤組織MED19 表達水平顯著增加[腫瘤組織：4.403（3.519，5.642），正常組織：2.310（2.063，2.617），W=1 422，P＜0.001，圖1A、1B]。將50 個正常組織及其對應的腫瘤組織進行配對分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織MED19 的表達高于正常組織（W=10，P＜0.001，圖1C）。通過HPA數(shù)據(jù)庫分析MED19 蛋白水平的變化，其免疫組化結(jié)果顯示，與正常組織相比，MED19 在肝癌組織中的表達增加。

圖1 MED19 在正常組織和肝癌組織中的表達Fig 1 The expression of MED19 in normal tissues and hepatocellular carcinoma tissues

2.2 MED19 表達與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性 將MED19 RNA 表達數(shù)據(jù)和臨床信息進行整合發(fā)現(xiàn)，與stage Ⅰ期肝癌患者相比，MED19 在stageⅡ、stageⅢ期患者中表達量增加[stageⅠ：4.243（3.446，4.890），stageⅡ：4.516（3.767，6.002），stage Ⅲ：4.894（3.369，6.547），stage Ⅳ：3.664（3.288，4.665），stage Ⅱvs. stageⅠ：W=5 828，P＜0.01，stageⅢvs. stageⅠ，W=5 707，P＜0.01，圖2A]。由于樣本的N（presence of cancer cells in draining and regional lymph nodes）分期、M（evidence for metastases）分期的數(shù)據(jù)信息不全，所以只對T（tumor burden）分期進行分析。結(jié)果表明，T2、T3、T4 期患者與T1 期相比，MED19 的表達水平增加 [T1: 4.237（3.424，4.897），T2：4.580（3.790，6.149），T3：4.884（3.342，6.418），T4：5.591（4.232，7.289），T2 vs. T1：W=6 485，P＜0.01，T3 vs.T1：W=5 758，P＜0.01，T4 vs.T1：W=770，P＜0.05，圖2B]。病理分級結(jié)果顯示，病理分級G3 的患者與分級G1的相比，MED19 的表達量升高 [G1: 3.204（2.474，5.065），G2：4.300（3.463，5.440），G3：4.656（3.808，6.484），G4：5.502（4.144，6.116），G3 vs. G1：W=2 656，P＜0.05，圖2C]。此外，MED19 表達量與患者的年齡和性別無關(guān)（圖2D、2E）。

圖2 MED19 mRNA 表達量與臨床分期、T 分期、病理分級、患者年齡和性別的關(guān)系Fig 2 The relationship between mRNA expression level of MED19 and clinical stage,T stage,pathological grade,age and sex of patients

2.3 肝癌患者MED19 表達量與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系 在各癌癥類型中，腫瘤可分為6 種免疫亞型：傷口愈合（C1）、干擾素-γ 顯性（C2）、炎癥性（C3）、淋巴細胞耗竭型（C4）、免疫安靜型（C5）、TGF-β 顯性（C6）。在肝癌患者中，MED19 的表達在5 種免疫分型之間具有差異（肝癌患者中無C5 亞型分型，H=48.375，P＜0.001，圖3A）。基于“ESTIMATE”算法，分析MED19 高、低表達組在免疫得分和基質(zhì)得分的差異。結(jié)果顯示，MED19 表達的高表達組與低表達組相比，基質(zhì)得分減少（W=14 363，P＜0.01，圖3B），而免疫得分沒有差異（W=17 678，P=0.647，圖3C）。

圖3 在肝癌患者中MED19 表達量與免疫分型和免疫評分的關(guān)系Fig 3 Relationship between MED19 expression level and immune typing and immune score in patients with hepatocellular carcinoma

2.4 MED19 表達與肝癌患者生存預后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存曲線分析了肝癌患者生存率與MED19 表達水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MED19 高表達的患者中位生存期明顯少于低表達患者（n=371，χ2=11.7，P＜0.001，圖4A）。同樣，GEPIA 數(shù)據(jù)庫中生存分析得到了相同的結(jié)果，MED19 高表達肝癌患者總體生存期縮短（圖4B）。采用單因素Cox 回歸分析年齡、性別、病理分級、臨床分期、T 分期和MED19表達量對肝癌患者預后的影響。結(jié)果表明，臨床分期、T 分期[stage Ⅲvs.stage Ⅰ（HR=2.713，95%CI:1.763～4.175，P＜0.001）、stage Ⅳvs. stageⅠ（HR=5.493，95%CI:1.691～17.841，P＜0.01）、T3 vs. T1（HR=2.593，95%CI:1.668～4.031，P＜0.001）、T4 vs.T1（HR=5.019，95% CI:2.230～11.299，P＜0.001）]，以及MED19 的高表達（HR=1.171，95%CI:1.087～1.261，P＜0.000 1）與患者不良預后相關(guān)；將單因素回歸分析有統(tǒng)計學差異的變量納入多因素Cox 分析中，結(jié)果顯示，MED19 高表達（HR=1.123，95% CI:1.036～1.216，P＜0.01）是肝癌患者獨立的不良預后因素（表1）。

表1 肝癌患者總生存率的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab 1 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival rate in patients with hepatocellular carcinoma

圖4 MED19 mRNA 表達量對肝癌患者生存率的影響Fig 4 The effect of MED19 mRNA expression on survival rate of patients with hepatocellular carcinoma

2.5 MED19 表達對信號通路的影響 首先，利用GSEA 分析MED19 的表達量對細胞信號通路的影響。在MED19 高表達的組別中，富集的基因集包括：剪接體、DNA 復制、核糖體、細胞周期和RNA 聚合酶通路。在MED19 低表達組別中，主要富集的基因通路包括：脂肪酸代謝、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸分解和丙酸代謝等（圖5A）。其次，篩選出MED19高、低表達組的差異基因共3 464 個，其中1 564 個基因在MED19 高表達組中表達上調(diào)，1 900 個基因表達下調(diào)。GO 分析結(jié)果顯示，在MED19 高表達組中表達上調(diào)基因主要富集在有絲分裂細胞周期、DNA 復制和細胞衰老等與癌癥相關(guān)的代謝通路（圖5B）。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，MED19 高表達組別中上調(diào)基因主要富集的通路包括：細胞周期、DNA復制和脂肪酸代謝等，下調(diào)基因主要富集的通路包括：脂肪酸代謝、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸分解和丙酸代謝等（圖5C）。

圖5 MED19 表達對信號通路的影響Fig 5 Effect of MED19 expression on signaling pathway

2.6 在癌癥中MED19 表達與藥物敏感性的相關(guān)性 MED19 表達水平與克拉屈濱（r=0.331，P=0.010）、白屈菜紅堿（r=0.313，P=0.015，）、羥基脲（r=0.290，P=0.025）和茚地替康（r=0.277，P=0.032）的敏感性呈正相關(guān)。

3 討論

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[16]。因為具有侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)頻繁的特點，肝癌在全球一直是一個主要的健康問題[17]。盡管目前治療肝癌已經(jīng)取得了進展，但肝癌患者的預后仍不令人滿意[18]。肝癌的發(fā)生和進展涉及遺傳因素和表觀遺傳改變的累積[19]。因此，研究肝癌發(fā)生、進展中的異常表達基因及其潛在機制對于探索肝癌的新治療靶點至關(guān)重要。

在基因轉(zhuǎn)錄過程中，Mediator 復合體能分別與轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶Ⅱ相互作用，進而廣泛參與二者之間的信息傳遞，被稱為真核生物基因轉(zhuǎn)錄的中央控制器[20]。MED19 是Mediator 復合體的亞基之一，在人類惡性腫瘤發(fā)展中具有重要作用[21]。之前的研究報道，在多種癌癥患者組織中，MED19 的表達水平升高。例如，在膀胱癌中，MED19 表達水平增加，并且能通過Wnt/β-catenin 信號通路促進癌癥進展；在乳腺癌中，MED19 能通過調(diào)節(jié)表皮生長因子以及下游的絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等[12-15]。以上研究說明MED19 發(fā)揮促癌作用[22-23]，可能成為癌癥治療干預的新靶點。

本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)庫，分析肝癌中MED19在腫瘤組織和正常組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MED19在肝癌組織中表達增加，并且高臨床分期以及高病理分級的患者與低級別患者相比，EMD19 的表達升高，這對肝癌有一定的診斷價值。在免疫分析中，MED19的表達在肝癌患者免疫分型中有明顯差異，表明在肝癌中，MED19 可能是免疫亞型中基因表達的調(diào)節(jié)因子。并且MED19 的高表達組與低表達組相比，基質(zhì)評分減少，即高表達腫瘤樣本中基質(zhì)細胞占比減少，說明MED19 表達量可能會影響肝癌患者的腫瘤微環(huán)境。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，MED19 mRNA 的高表達使肝癌患者的生存率降低。Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)MED19 是預測肝癌患者預后的獨立危險因子。此外，GSEA 分析的結(jié)果顯示，MED19高表達組在RNA 聚合酶通路富集，與其介導RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄功能密切相關(guān)。同時MED19 高表達還在DNA 復制、細胞周期等通路富集。篩選MED19高表達組和低表達組差異基因進行GO 和KEGG富集分析，結(jié)果表明，在MED19 高表達組中，上調(diào)基因也主要富集在有絲分裂細胞周期、DNA 復制和細胞衰老等通路，這與GSEA 結(jié)果一致，提示MED19可能通過調(diào)控以上通路發(fā)揮促癌作用。同時，GSEA、GO 和KEGG 結(jié)果顯示，MED19 高表達引起脂代謝和氨基酸代謝等通路的下調(diào)，提示MED19還可能與脂代謝和氨基酸代謝通路相關(guān)。

利用Cellminer 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MED19 表達量與抗癌藥物克拉屈濱、白屈菜紅堿、羥基脲和茚地替康的敏感性呈正相關(guān)?？死鼮I是脫氧腺苷的口服核苷類似物，適用于治療復發(fā)型多發(fā)性硬化癥和毛細胞白血病等[24-25]。白屈菜紅堿是一種天然苯并啡啶類生物堿，存在于許多草藥中，具有廣泛的抗腫瘤活性，其能抑制前列腺癌、宮頸癌和三陰性乳腺癌等的進展[26-27]。羥基脲是一種簡單的有機化合物，目前在臨床上用作癌癥化學治療劑。它能通過抑制核糖核苷二磷酸還原酶，特異性作用于細胞周期的S 期，從而阻礙核糖核苷酸向脫氧核糖核苷酸的還原轉(zhuǎn)化，限制從頭DNA 合成。羥基脲在治療惡性黑色素瘤和頭頸癌中能發(fā)揮重要作用[28-29]。茚地替康是一種新型DNA 拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑。DNA拓撲異構(gòu)酶可以分為喜樹堿類和非喜樹堿類化合物，茚地替康屬于非喜樹堿類，因其能克服喜樹堿化合物穩(wěn)定性差、不良反應大等缺點，將有望在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮重要作用[30]。分析結(jié)果顯示，MED19 的表達量與以上抗腫瘤藥物敏感性呈正相關(guān)，表明MED19 在癌癥中表達升高能增加腫瘤細胞對以上抗腫瘤藥物的敏感性。該結(jié)果為其藥物開發(fā)提供了前期數(shù)據(jù)支持。

綜上，本研究首次明確了MED19 在肝癌患者中的表達變化及其具有的預后意義，為肝癌的診斷和預后發(fā)掘了可能的基因標志物，其潛在分子機制值得進行深入探索和研究。