閆紅敏，于蘭蘭，郭子燕，張 瑋

(1.河南省直第三人民醫(yī)院， 河南 鄭州 450006； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450004)

五行香草方由白芷、川芎、藁本、防風(fēng)、細(xì)辛5味中藥組成，是河南省直第三人民醫(yī)院在臨床實(shí)踐中總結(jié)的純中藥外用方，可作用于足底特殊穴位，對(duì)腳氣、腳臭、骨刺等有顯著的治療作用[1]。方中白芷祛風(fēng)濕止癢[2]，可潤澤皮膚而治療皮膚疾患[3-4]；川芎活血祛風(fēng)[5]，外用有抑菌和體外促透作用[6]；藁本祛風(fēng)散寒止痛，其水煎劑對(duì)皮膚癬菌有抑制作用[7]；防風(fēng)祛風(fēng)止痙[8]，外用具有抑菌作用[9-10]；細(xì)辛祛風(fēng)止痛[11]，其所含的揮發(fā)油為廣譜抗真菌藥物，其中細(xì)辛揮發(fā)油中黃樟醚為抗真菌主要有效成分[12-14]。本研究在五行香草處方的基礎(chǔ)上，應(yīng)用現(xiàn)代制藥技術(shù)[15-16]制備五行香草軟膏，建立五行香草軟膏的多指標(biāo)成分含量測定方法，為五行香草軟膏的質(zhì)量研究提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 藥品、試劑與儀器

白芷(批號(hào)B712191-01)、川芎(批號(hào)B810103-01)、防風(fēng)(批號(hào)B710304-01)，均購自河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司；細(xì)辛，購自湖北聚瑞中藥飲片有限公司，批號(hào)170701；藁本，購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號(hào)1707005。所有藥材均由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院劉秋艷主任藥師鑒定，符合《中國藥典》2020版一部各品種項(xiàng)下規(guī)定[17]。細(xì)辛脂素，中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品，批號(hào)111889-201504；升麻素苷(批號(hào)Y31M9H62747)、阿魏酸(批號(hào)H25M6L1)、歐前胡素(批號(hào)P02J9F64791)，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、正丁醇、磷酸二氫鉀、甲醇均為分析純，為天津市永大化學(xué)有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，為西格瑪試劑有限公司產(chǎn)品。BSA224S-CW電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；Waters e2695高效液相色譜儀，美國沃特世有限公司產(chǎn)品；85-2A雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠產(chǎn)品；HK250科導(dǎo)臺(tái)式超聲波清洗儀器，上海漢克科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 五行香草軟膏的制備

2.1.1 處方及基質(zhì)的選取

五行香草軟膏由白芷、防風(fēng)、細(xì)辛、川芎、藁本5味中藥組成。根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇O/W型基質(zhì)，五行香草軟膏的乳化工藝為溫度68 ℃、轉(zhuǎn)速500 r/min、乳化時(shí)間45 min。

2.2 建立定量測定方法

2.2.1 制備供試品溶液

精密稱取5 g樣品，放入具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，進(jìn)行兩次上述操作并過濾，合并濾液并蒸干；加入氨水20 mL溶解殘?jiān)?，用乙酸乙酯萃?次，每次30 mL；棄去乙酸乙酯層，水層用水飽和正丁醇萃取3次，每次30 mL；合并正丁醇液，蒸干；殘?jiān)尤爰状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，搖勻并過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 制備對(duì)照品溶液

分別取歐前胡素、阿魏酸、升麻素苷、細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成含歐前胡素43.8 mg/L、阿魏酸63.4 mg/L、升麻素苷51.9 mg/L、細(xì)辛脂素53.8 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-5.0 mmoL/L KH2PO4溶液(B)(以稀H3PO4調(diào)節(jié)pH值至3.0)；梯度洗脫為0-5 min,15%A;5-30 min,5%A～80%A; 30-32 min,80%A～15%A，32-40 min,15%A；流速1.0 mL/min，檢測波長287 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。上述色譜條件下，混合對(duì)照品、五行香草軟膏及陰性樣品的色譜圖見圖1。

1.升麻素苷; 2.阿魏酸;3.歐前胡素;4.細(xì)辛脂素A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺防風(fēng)陰性樣品；D.缺川芎、藁本陰性樣品；E.缺白芷陰性樣品；F.缺細(xì)辛陰性樣品圖1 混合對(duì)照品、供試品和陰性樣品的高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

取適量2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，阿魏酸分別為6.34，9.51，12.68，15.85，19.02，31.70 mg/L，升麻素苷分別為5.19，7.79，10.38，12.98，15.57，25.95 mg/L，歐前胡素分別為4.38，6.57，8.76，10.95，13.14，21.90 mg/L，細(xì)辛脂素分別為5.35，8.03，10.70,13.38，16.05，26.75 mg/L，在實(shí)驗(yàn)所需的色譜條件下進(jìn)樣測定，取對(duì)照品的峰面積(A) 為縱坐標(biāo)，濃度(C) 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

表1 4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液10 μL，用上述2.2.3項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測峰面積，計(jì)算升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細(xì)辛脂素峰面積的RSD分別為0.88%、0.95%、0.92%、0.67%。結(jié)果表明，該方法所用儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用2.2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，按照2.2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細(xì)辛脂素的RSD分別為1.07%、0.72%、1.56%、1.16%。結(jié)果表明，供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一五行香草方供試品溶液，分別在室溫下存放0，2，4，8，12，24 h后，采用2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果：升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細(xì)辛脂素的RSD分別為0.59%、0.96%、1.13%、1.43%。結(jié)果表明，供試品溶液所含的4種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的五行香草軟膏樣品6份，分別加入混合對(duì)照品溶液1 mL，按照2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用2.2.3.項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，按以下公式計(jì)算供試品溶液中各對(duì)照品的總量和對(duì)照品的加樣回收率。

供試品含量=測得量(μg)/進(jìn)樣體積(μL)×溶液體積(50 mL)

加樣回收率=[測得對(duì)照品總量(μg)-樣品中對(duì)照品含量(μg)]/對(duì)照品加入量(μg)×100%

升麻素苷、阿魏酸、歐前胡素、細(xì)辛脂素的平均回收率分別為99.81%、99.53%、101.87%、97.35%,RSD分別為1.56%、2.86%、1.19%、2.23%。結(jié)果表明，該方法的回收率符合要求。

2.2.9 五行香草軟膏樣品的含量測定結(jié)果

按2.2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照2.2.3 色譜條件進(jìn)樣，測定樣品中的歐前胡素、阿魏酸、升麻素苷、細(xì)辛脂素含量，結(jié)果見表2。

表2 五行香草軟膏樣品的含量測定結(jié)果μg·g-1

3 討 論

隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥制劑的劑型越來越多元化，院內(nèi)制劑得到了空前發(fā)展。本研究考慮到五行香草軟膏的主治病癥為腳氣病，膿包、潰爛不可避免，而油脂性基質(zhì)較油膩，疏水性大，不適于炎性滲出的創(chuàng)面。水溶性基質(zhì)多由水溶性高分子物質(zhì)組成，無刺激性[20-21]，結(jié)合釋藥速率、延展性、穩(wěn)定性等多重因素，選擇了O/W型乳膏劑，不僅釋藥速率快，對(duì)破損皮膚的刺激性較小，安全性更高。

筆者通過查閱文獻(xiàn)[22-25]選取歐前胡素、阿魏酸、細(xì)辛脂素、升麻素苷作為五行香草軟膏的定量測定指標(biāo)，考慮到指標(biāo)多而采用梯度洗脫，在檢測波長287 nm、柱溫30 ℃的色譜條件下進(jìn)行檢測以確保測定指標(biāo)均能在對(duì)應(yīng)譜圖中出峰。其中細(xì)辛脂素來源于細(xì)辛，阿魏酸來源于川芎、藁本，歐前胡素來源于白芷，升麻素苷來源于防風(fēng)，4種成分無干擾即專屬性良好，且有良好的精密度和重現(xiàn)性，可用于五行香草軟膏的定量測定。本實(shí)驗(yàn)含量測定穩(wěn)定性好，數(shù)據(jù)可靠，為五行香草軟膏作為院內(nèi)制劑的開發(fā)提供了理論支撐。