張婉菊，謝太震，陳夢(mèng)多，王藝茹，沈虎生，何夢(mèng)菡，樸鳳植，申順善

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 鄭州 450002）

黃瓜枯萎病是由無(wú)性態(tài)真菌尖孢鐮孢菌黃瓜?；停╢. sp.）引起的一種毀滅性土傳病害，在黃瓜整個(gè)生育期均能產(chǎn)生危害，在露地和保護(hù)地栽培中均可發(fā)生，尤其是在黃瓜連作地發(fā)生更為嚴(yán)重。目前，黃瓜枯萎病的防治以化學(xué)防治為主，但使用化學(xué)農(nóng)藥容易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致防效降低，且化學(xué)農(nóng)藥易殘留，容易引起環(huán)境污染和人畜安全等問(wèn)題。植物病害的生物防治具有安全、無(wú)毒、環(huán)保等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了植物病害傳統(tǒng)防治方法的缺陷，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分廣闊的應(yīng)用前景，尤其在蔬菜病害防治方面優(yōu)勢(shì)顯著。目前，利用生防細(xì)菌防治黃瓜枯萎病的研究比較活躍，已報(bào)道的黃瓜枯萎病生防細(xì)菌主要有解淀粉芽孢桿菌（）、枯草芽孢桿菌（）、蠟樣芽孢桿菌（）等芽孢桿菌屬和銅綠假單胞菌（）、熒光假單胞菌（）、弗雷德里克斯堡假單胞菌（）等假單胞菌屬。如，解淀粉芽孢桿菌（.）SF1103 和枯草芽孢桿菌（.）SF1104 對(duì)黃瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗能力，能有效防治黃瓜枯萎病，同時(shí)對(duì)黃瓜的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；蠟樣芽孢桿菌（.）Y3F 能分泌抑制病原菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，顯著降低黃瓜根際土壤真菌和尖孢鐮孢菌數(shù)量；銅綠假單胞桿菌（.）BA5 對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲抑制率達(dá)58.33%，能有效防治黃瓜枯萎病；熒光假單胞桿菌（.）對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲抑制率達(dá)87.04%，降低了黃瓜枯萎病發(fā)病率；弗雷德里克斯堡假單胞菌（.）33-1 對(duì)黃瓜枯萎病具有很好的防治效果，防效達(dá)86.95%，同時(shí)對(duì)黃瓜具有促生作用。

目前，在生產(chǎn)上應(yīng)用于黃瓜枯萎病生物防治的高效生防菌株還是有限。筆者從番茄根系分離篩選出生防細(xì)菌LK2-3，研究其對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制效果，確認(rèn)其對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果、對(duì)黃瓜的促生效果及其根際定殖能力，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，為黃瓜枯萎病的生物防治提供生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株LK2-3 為2020 年分離自河南省駐馬店采集的健康番茄根系，采用逐步提高誘導(dǎo)濃度的方法獲得穩(wěn)定抗利福平（100 μL·mL）的菌株，保存于-80 ℃超低溫冰箱；黃瓜枯萎病菌尖孢鐮孢菌黃瓜?；停?f. sp.）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治研究室提供；供試黃瓜品種為寒育6 號(hào)，是河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司選育的抗枯萎病品種；供試培養(yǎng)基為TSA 培養(yǎng)基（TSB 30 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）、PDA 培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）、PDB 培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL）和PDK 培養(yǎng)基（PDB 20 g，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）。

1.2 方法

試驗(yàn)于2021 年1—12 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治研究室進(jìn)行。

1.2.1 LK2-3 菌懸液的配制 將LK2-3 在TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h 后，用0.1 mol·LMgSO溶液配制成10cfu·mL的LK2-3 菌懸液。

1.2.2 尖孢鐮孢菌孢子懸浮液的配制 將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的尖孢鐮孢菌菌餅接種到PDB 培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床（28 ℃，160 r·min）培養(yǎng)5 d，然后用無(wú)菌水稀釋配制成1×10孢子·mL的孢子懸浮液。

1.2.3 LK2-3對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制活性測(cè)定 采用平板對(duì)峙法測(cè)定LK2-3 對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。將尖孢鐮孢菌菌餅放在PDK 培養(yǎng)基平板中央，在距離菌餅25 mm 處接種LK2-3，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后調(diào)查抑菌帶大小。采用懸滴法測(cè)定LK2-3 對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制活性。取等量的LK2-3 菌懸浮液（10cfu·mL）和尖孢鐮孢菌分生孢子懸浮液混合均勻，取20 μL 滴到凹玻片上，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱里保濕培養(yǎng)，每隔2 h 在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，每次共觀察3 個(gè)視野，每個(gè)視野大概100個(gè)分生孢子，以無(wú)菌水和尖孢鐮孢菌分生孢子懸浮液混合作對(duì)照。

孢子萌發(fā)率/%= 萌發(fā)孢子數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100；

孢子萌發(fā)抑制率/%=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100。

1.2.4 LK2-3的防病效果和促生效果測(cè)定 采用盆栽試驗(yàn)測(cè)定LK2-3 對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果和對(duì)黃瓜的促生效果。試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)處理，即清水處理（CK）、LK2-3 處理、枯萎病菌處理（FOC）、枯萎病菌和LK2-3 處理（FOC+LK2-3），隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。將2 片真葉的黃瓜苗移栽至花盆（直徑9 cm），用LK2-3 菌懸液（10cfu·mL）進(jìn)行灌注處理（100 mL·株），然后沿花盆邊緣灌注接種黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液（10 mL·株），在育苗室培育15 d 后，按照分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查枯萎病發(fā)病程度，并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。同時(shí)，測(cè)定黃瓜株高、莖粗、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量等黃瓜生育指標(biāo)。調(diào)查黃瓜枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)為植株正常生長(zhǎng)，不發(fā)??；1 級(jí)為植株有≤1/4 的葉片萎蔫；2 級(jí)為植株有＞1/4、≤2/4 的葉片萎蔫；3 級(jí)為植株有＞2/4、≤3/4的葉片萎蔫；4 級(jí)為植株萎蔫死亡。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；

防治效果/%=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.2.5 LK2-3的根際定殖密度測(cè)定 采用稀釋涂布平板法測(cè)定LK2-3 的根際定殖密度，用LK2-3 菌懸液（10cfu·mL）進(jìn)行灌根處理（100 mL·株）15 d 后測(cè)定LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤的定殖密度。測(cè)定根系的定殖密度：輕輕拔出黃瓜根系，用流水沖洗干凈，吸干根表面的水分，稱取1 g 根系，研磨后用0.1 mol·LMgSO溶液稀釋一定濃度涂抹在添加利福平的TSA 培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，待形成菌落，檢測(cè)菌落數(shù)并推算出在黃瓜根系的LK2-3 定殖密度；測(cè)定根際土壤中的定殖密度：取1 g 根際土壤，用0.1 mol·LMgSO溶液稀釋一定濃度涂抹在添加利福平的TSA 培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)同上，待形成菌落，檢測(cè)其定殖密度。

1.2.6 LK2-3的鑒定 LK2-3 菌株的形態(tài)特征及生理生化特性主要參考《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》，按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行鑒定。將LK2-3 菌株在TSA 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)72 h 后，觀察單菌落的形態(tài)、顏色、大小、透明度、光澤及邊緣特征等。采用革蘭氏染色法觀察LK2-3 菌體形態(tài)。

16S rRNA 序列同源性分析：將LK2-3 在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，挑取細(xì)菌單菌落提取RNA，采用通 用 引 物27 f（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3’）和 1492 r（5’- TACGGHTACCTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系（DNA：1 μL，Primer：各1 μL，Mix：25 μL，ddHO：22 μL），PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI BLAST進(jìn)行序列分析，并采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以最小顯著差數(shù)法（LSD）分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LK2-3對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制活性

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，LK2-3 在PDK 培養(yǎng)基上對(duì)尖孢鐮孢菌形成明顯的抑菌帶，其直徑為0.55 cm（圖1）。黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，在無(wú)菌水中培養(yǎng)2 h 時(shí)分生孢子萌發(fā)率為37.50%，培養(yǎng)8 h 時(shí)萌發(fā)率達(dá)到81.13%，而LK2-3處理的分生孢子培養(yǎng)2 h 時(shí)萌發(fā)率為16.63%，培養(yǎng)8 h 時(shí)萌發(fā)率為41.67%，培養(yǎng)8 h 時(shí)對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制率達(dá)48.64%（圖2）。說(shuō)明LK2-3 菌株對(duì)尖孢鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有明顯抑制效果。

圖1 LK2-3 對(duì)尖孢鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

圖2 LK2-3 對(duì)尖孢鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響

2.2 LK2-3對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜接種枯萎病菌后植株生長(zhǎng)明顯受到抑制，處理10 d 時(shí)開始表現(xiàn)萎蔫癥狀，到15 d 時(shí)病情指數(shù)達(dá)到50.00，而LK2-3 處理的黃瓜15 d 時(shí)生長(zhǎng)仍然良好，枯萎病病情指數(shù)僅為5.56，LK2-3 處理對(duì)黃瓜枯萎病具有顯著的防治效果，防治效果達(dá)到88.89%（表1）。由圖3 也可明顯看出，處理15 d 時(shí)LK2-3 對(duì)黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果。

圖3 LK2-3 處理15 d 對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果

表1 LK2-3 處理對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果

2.3 LK2-3對(duì)黃瓜的促生效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，LK2-3 處理對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)具有顯著的促生效果。LK2-3 處理15 d 后，黃瓜株高和莖粗分別為7.27 cm 和3.55 mm，比對(duì)照增加32.18%、54.35%；LK2-3 處理的黃瓜葉鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別為6.36 g·株和0.82 g·株，比對(duì)照增加160.66%和128.61%；LK2-3 處理的黃瓜根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對(duì)照增加480.00%和223.33%。接種黃瓜枯萎病菌（FOC）的條件下LK2-3 處理同樣具有顯著的促生效果（表2）。說(shuō)明LK2-3 處理不僅能夠防治黃瓜枯萎病，而且對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)和根系發(fā)育也具有明顯的促進(jìn)作用，由圖3和圖4 也可看出LK2-3 處理明顯促進(jìn)了黃瓜地上部生長(zhǎng)和根系發(fā)育。

表2 LK2-3 對(duì)黃瓜的促生效果

圖4 LK2-3 處理15 d 對(duì)黃瓜的促生效果

2.4 LK2-3的定殖密度

進(jìn)行盆栽試驗(yàn)測(cè)定LK2-3 根際定殖密度的結(jié)果，處理15 d 后LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤的定殖密度分別達(dá)到1.44×10cfu·g和1.12×10cfu·g（表3），表明LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤具有穩(wěn)定的定殖密度，為其發(fā)揮促生防病作用奠定了基礎(chǔ)。

表3 LK2-3 在黃瓜根際定殖密度

2.5 LK2-3的鑒定

LK2-3 在TSA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色、不透明、表面不光滑、邊緣不規(guī)則的菌落（圖5）。LK2-3 的菌體為直桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，在5～50 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最高耐鹽濃度為11%，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、丙酸鹽、丁酸鹽和山梨醇，硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化、淀粉水解反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，亞硝酸鹽還原反應(yīng)呈陰性（表4）。另外，以LK2-3 菌株總RNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出的16S rRNA 長(zhǎng)度約為1.5 kb，對(duì)其序列進(jìn)行NCBI BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示，與枯草芽孢桿菌16S rRNA 序列同源性達(dá)到99%。利用MEGA 軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，與枯草芽孢桿菌（LC506466.1）在一個(gè)分支，其支持度為99%（圖6）。因此，根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析，將LK2-3 菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（）。

圖6 LK2-3 的系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 LK2-3 的形態(tài)特征和生理生化特性

圖5 LK2-3 的培養(yǎng)形態(tài)

3 討論與結(jié)論

黃瓜枯萎病菌是由厚垣孢子在土壤中長(zhǎng)期存活，土壤中的菌絲和厚垣孢子萌發(fā)從植物根或根莖部侵入，在維管束內(nèi)寄生的一種系統(tǒng)性病害。在枯萎病菌的生活史中能夠抑制任何一個(gè)發(fā)育階段都是防治枯萎病的有效途徑。圓圓等發(fā)現(xiàn)，生防菌S-101 不僅能抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)，又能抑制孢子萌發(fā)，從而抑制病原菌的無(wú)性繁殖；李晶等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B29 菌株不僅能抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)，又能抑制孢子萌發(fā)，對(duì)黃瓜枯萎病有顯著的防治效果。本研究結(jié)果表明，LK2-3 菌株能夠抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，能夠有效切斷枯萎病菌的繁殖，有效防治黃瓜枯萎病，同時(shí)，LK2-3 對(duì)黃瓜植株生長(zhǎng)表現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用，顯示出良好的生防潛力。

生防菌的根際定殖能力是其發(fā)揮效果的前提，其在植物根際定殖能力的強(qiáng)弱及穩(wěn)定性是決定生物防治成功與否的關(guān)鍵，決定了其潛在生防作用的大小。生防菌的定殖包括兩個(gè)方面，一是能夠在植物根際生存下來(lái)，二是能適應(yīng)植物根際環(huán)境而大量繁殖。連玲麗等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（.）EN5 可以在其自然寄主番茄的根、莖及根際土壤中穩(wěn)定定殖，顯著改善根際土壤微生態(tài)環(huán)境，抑制病菌繁殖；王晶晶等發(fā)現(xiàn)，普城沙雷菌（）K9-3 和綠針假單胞菌（）L14-2 均具有良好的根際定殖能力，能有效防治煙草黑脛??；劉錦霞等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（.）SW11 表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗逆和復(fù)雜生態(tài)環(huán)境適應(yīng)能力，既可以在番茄根際土壤中定殖生存，又可以定殖于番茄植株的各個(gè)部位，成為番茄植株及其根際的有益微生物種群之一，顯示了良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果表明，LK2-3 菌株在黃瓜根系和根際土壤成功定殖，且在根系和根際土壤能夠保持10cfu·g和10cfu·g的定殖密度，具有良好的定殖能力。

芽孢桿菌因具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、有較強(qiáng)的耐熱性及抗逆性、在植物表面易于存活與繁殖、制劑的穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)成為植物病害生物防治中研究應(yīng)用最多，同時(shí)靶標(biāo)病害種類也比較多的一類生防細(xì)菌。如，蠟質(zhì)芽孢桿菌（.）AR156 對(duì)水稻紋枯病具有較好的防治效果，側(cè)孢芽孢桿菌（.）B113 對(duì)番茄早疫病有較好的防治效果，多粘類芽孢桿菌（）CF05 對(duì)鐵皮石斛細(xì)菌性葉斑病具有防治效果，枯草芽孢桿菌（.）B-33 對(duì)稻瘟病菌具有抑制作用。本試驗(yàn)中篩選的LK2-3 是枯草芽孢桿菌（.），能產(chǎn)生芽孢，具有較強(qiáng)的抗逆性，在黃瓜枯萎病防治方面具有很好的應(yīng)用潛力。

綜上所述，枯草芽孢桿菌LK2-3 對(duì)枯萎病菌的抑菌活性較高，具有良好的定殖能力，可有效防治黃瓜枯萎病，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，有較好的應(yīng)用潛力。生防細(xì)菌的防病促生機(jī)制是多方面的，是生防細(xì)菌的推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。下一步需要深入研究LK2-3 菌株的防病促生機(jī)制，并進(jìn)一步探究其高效利用技術(shù)，為黃瓜枯萎病的綠色防控提供重要的理論和技術(shù)支撐。