耿麗華，史 越，張國(guó)裕，李海真，宋順華

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所 北京 100097）

西葫蘆（L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在北京的生產(chǎn)以果實(shí)作為蔬菜為主，其含有較多的維生素C，具有較高的栽培價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。近年來(lái)，由于長(zhǎng)期的連作使得土傳病害日益蔓延，因此在栽培過(guò)程中容易受到病害的危害，并造成極大的損失。西葫蘆根腐病一直是保護(hù)地種植中西葫蘆的重要病害，主要造成植株萎蔫和爛根，國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道。該病發(fā)病率高，往往導(dǎo)致發(fā)病植株死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道可引起西葫蘆萎蔫和根腐的病原菌很多，而且差異很大，主要的病原菌有疫霉菌、露濕擬漆斑菌和腐皮鐮刀菌，均為常見(jiàn)的土壤習(xí)居菌，但導(dǎo)致北京地區(qū)西葫蘆根腐病的病原菌種類尚未見(jiàn)報(bào)道。

2020 年5 月，京郊四季青試驗(yàn)基地溫室栽培的西葫蘆出現(xiàn)了一種新的根部病害，該病害在初花期開(kāi)始發(fā)生，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有植株萎蔫時(shí)，病株率已經(jīng)達(dá)到30%以上。仔細(xì)觀察萎蔫植株，其根部腐朽，用手輕輕向上拉動(dòng)植株地上部分，植株可以從莖基部斷開(kāi)，切開(kāi)其莖基部可見(jiàn)維管束褐化。為弄清京郊發(fā)生的西葫蘆根腐病病原，筆者采集典型發(fā)病植株，對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)一步對(duì)該病原菌的致病范圍進(jìn)行了測(cè)定,以期為該病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試發(fā)病植株：具有典型發(fā)病癥狀的西葫蘆植株于2020 年5 月在京郊四季青試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)的溫室內(nèi)采集。

供試品種：試驗(yàn)所用的西葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜、番茄、辣椒、茄子、白菜、油菜、甘藍(lán)、蘿卜等26 個(gè)品種（表1），均從京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司購(gòu)買。

表1 供試蔬菜品種

試劑及儀器：真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，北京新時(shí)代眾合科技有限公司；其他無(wú)機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂17 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL；康乃馨水瓊脂培養(yǎng)基（carnation leaf agar，CLA）：瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、每個(gè)6 cm 直徑的培養(yǎng)基平板上加入大小約為4 mm的康乃馨葉片4～5 塊。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose，PD）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL。所有培養(yǎng)基使用之前均于120 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法，從典型發(fā)病植株根莖的病健交界處取小塊組織，在75%乙醇溶液中浸泡2 s，用滅菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分，放置在PDA 平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)出，分離菌株并單孢純化。

1.2.2 分離物致病性測(cè)定 將分離物在25 ℃條件下PDA 培養(yǎng)7 d，從菌落邊緣取直徑為5 mm 左右的菌絲塊5 個(gè)，加入裝有250 mL PD 液體培養(yǎng)基的平底瓶（500 mL）中，120 r·min、25 ℃振蕩培養(yǎng)7 d后過(guò)濾，將過(guò)濾液離心收集孢子，加無(wú)菌水配制成濃度為1×10個(gè)·mL的孢子懸浮液，備用。將滅菌的栽培土（∶∶＝4∶2∶1）按10∶1 的比例與孢子懸液混合均勻，裝入口徑210 mm 營(yíng)養(yǎng)缽供播種用。將供試種子分別于2%NaCl 溶液浸泡5 min，撈出控干水分，催芽后播種；每缽播10 粒出芽種子，每個(gè)品種播種2 缽（接菌和不接菌對(duì)照各1缽），置于25～30 ℃溫室中常規(guī)管理。3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)置。

播種后，觀察植株的發(fā)病情況，同時(shí)對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行癥狀觀察、病原菌分離及病原菌形態(tài)觀察和比較。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：在25 ℃黑暗條件下，PDA 培養(yǎng)病原菌，觀察菌落形態(tài)并測(cè)量其7 d 的平均生長(zhǎng)速率；在25 ℃黑暗條件下，CLA 培養(yǎng)病原菌，顯微觀察大型分生孢子、小型分生孢子，在倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式。依據(jù)Leslie 和Summerell 等相關(guān)分類方法進(jìn)行種類鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：在25 ℃條件下，PDA 培養(yǎng)病原菌5 d，收集菌絲體，加液氮研磨成粉末，用試劑盒提取其DNA；采用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行該病原菌rDNA 核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR 擴(kuò)增，并進(jìn)一步采用翻譯延伸因子-引物EF-1/EF-2進(jìn)行-序列的PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系及擴(kuò)增參照耿麗華等的方法進(jìn)行。擴(kuò)增片段由北京新時(shí)代眾合科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的序列在NCBI 中檢索并下載同源序列，然后使用MEGA 7 軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自舉法對(duì)發(fā)育樹進(jìn)行1000 次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.4 病原菌致病范圍測(cè)定 每個(gè)品種挑選10 粒經(jīng)過(guò)催芽的種子用于播種。病原菌接種方法、播種和管理方法同1.2.2。試驗(yàn)均設(shè)不接種作為對(duì)照。播種后，觀察記錄植株的發(fā)病和死亡情況。以地上部出現(xiàn)萎蔫、植株死亡或莖基部出現(xiàn)褐化為發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病率為發(fā)病株數(shù)占供試株數(shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物及其致病性測(cè)定

取西葫蘆發(fā)病植株莖基部的病健交接處進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得2 個(gè)分離物。經(jīng)過(guò)致病性測(cè)定，其中1 個(gè)分離物能夠使西葫蘆發(fā)病，可觀察到接種發(fā)病的西葫蘆幼苗的莖基部褐化，同時(shí)，所設(shè)未接種的對(duì)照生長(zhǎng)正常、沒(méi)有任何癥狀（圖1）。對(duì)接種發(fā)病植株進(jìn)行分離培養(yǎng)，再次獲得的分離物與所接種的分離物形態(tài)一致，證明該分離物為病原菌。另一個(gè)分離物不能使西葫蘆發(fā)病，不是該病害的病原菌。

圖1 致病性測(cè)定

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 由圖2 可以看出，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落為圓形，邊緣整齊，菌絲呈灰色絨毛狀，從菌落背面可以觀察到棕色色素；25 ℃條件下PDA 培養(yǎng)7 d，其生長(zhǎng)速率為9.8 mm·d左右。

圖2 菌落形態(tài)

由圖3 可以看出，病原菌在CLA 培養(yǎng)基上，大型分生孢子稍彎曲，3～7 個(gè)隔，以4～5 個(gè)隔為多；小型分生孢子橢圓形、腎形或卵形，0～1 個(gè)隔，多數(shù)無(wú)隔；小型分生孢子最初聚生在長(zhǎng)單瓶梗上的圓形假頭內(nèi)，隨著小型分生孢子的成長(zhǎng)，假頭的包膜逐漸變薄，最后包膜徹底溶解，小型分生孢子分散出來(lái)。

圖3 病原菌分生孢子顯微形態(tài)特征

上述形態(tài)特征與腐皮鐮刀菌相符。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 提取該病原菌的DNA，對(duì)rDNA-ITS 和-序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得片段大小分別為587 bp 和726 bp。將這2 個(gè)序列分別提交至NCBI 進(jìn)行同源序列檢索，結(jié)果均與腐皮鐮刀菌的序列同源性最高，達(dá)到99%。

基于該病原菌的-序列與NCBI 中屬的相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），該病原菌（Xh-EF）與KF372878 腐皮鐮刀菌菌株聚在同一分支，表明該病原菌為腐皮鐮刀菌。

圖4 基于TEF-1α 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病原菌致病范圍測(cè)定

由表2 可以看出，在接種后第21 天時(shí)，供試的4 個(gè)西葫蘆品種發(fā)病程度有較大差異，京葫1 號(hào)、京珠、京碧和京葫2 號(hào)植株發(fā)病率分別為70.00%、20.00%、10.00%和0。發(fā)病率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，接種后第35 天時(shí)，4 個(gè)品種的發(fā)病率均達(dá)到100.00%。南瓜和黃瓜在接種后第28 天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病率在品種間存在較大的差異，到接種后第42 天，黃瓜京研綠玲瓏2 號(hào)和京研優(yōu)勝的發(fā)病率分別為100.00%和60.00%；接種后第49天時(shí)，南瓜京欣砧6 號(hào)和京欣砧4 號(hào)的發(fā)病率分別為100.00%和10.00%。供試西瓜和甜瓜品種發(fā)病較晚，分別在接種后第42 天和第49 天才開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，西瓜華欣和京穎的植株發(fā)病率均為60.00%，2 個(gè)品種的發(fā)病率沒(méi)有差異；甜瓜京玉30和京玉綠寶的植株發(fā)病率分別為20.00%和25.00%，品種間發(fā)病率差別較小。供試的十字花科和茄科蔬菜的所有品種到接種后第49 天時(shí)都沒(méi)有出現(xiàn)發(fā)病癥狀，植株發(fā)病率均為0。

表2 人工接種后不同蔬菜品種的植株病死率 %

3 討論與結(jié)論

針對(duì)京郊發(fā)生的西葫蘆根腐病，筆者通過(guò)病原菌分離，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明病原菌為腐皮鐮刀菌，這與我國(guó)已報(bào)道的西葫蘆根腐病病原菌不同，而與西班牙Ana 等報(bào)道的結(jié)果相同。

已有的研究表明，腐皮鐮刀菌的寄主范圍非常廣泛。據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道，它可導(dǎo)致甜瓜、西瓜、番茄和辣椒的根腐病，國(guó)外也有該菌為害西瓜、黃瓜、甜瓜和南瓜，引起根腐病的研究報(bào)道，但腐皮鐮刀菌導(dǎo)致西葫蘆根腐病在我國(guó)尚屬初次報(bào)道。致病范圍研究結(jié)果表明，引起西葫蘆根腐病的腐皮鐮刀菌能導(dǎo)致葫蘆科蔬菜的所有供試品種發(fā)病，但是不能導(dǎo)致茄科蔬菜和十字花科蔬菜的所有供試品種發(fā)病，這與Ana 等報(bào)道的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果還表明，該病原菌在葫蘆科的不同品種之間表現(xiàn)出致病性的差異。其中西葫蘆發(fā)病最早，病情發(fā)展迅速，而其他葫蘆科蔬菜均比西葫蘆發(fā)病晚，發(fā)病率也較低。同一種類的不同品種也存在感病性的差異，在接種后21 d 時(shí)，4 個(gè)西葫蘆品種的植株發(fā)病率為0～70.00%，2 個(gè)南瓜品種在接種后49 d 時(shí)，發(fā)病率分別為10.00%和100.00%，因此，不同品種間的感病性有非常明顯的差別。本研究的致病范圍測(cè)定是在病原菌孢子接種壓力極大的條件下進(jìn)行的，進(jìn)一步研究可通過(guò)適當(dāng)降低接種壓力對(duì)葫蘆科蔬菜進(jìn)行品種抗病性鑒定，從而篩選出相對(duì)抗病的品種或種質(zhì)資源。

腐皮鐮刀菌根腐病是土傳病害，在發(fā)病初期不容易被生產(chǎn)者發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)植株萎蔫癥狀，殺菌劑的防治效果不理想。筆者通過(guò)病原菌分離鑒定、較為系統(tǒng)的病原菌致病范圍測(cè)定，對(duì)于有針對(duì)性地防治該病害具有指導(dǎo)性的意義。依據(jù)本文的研究結(jié)果，為了有效防控腐皮鐮刀菌根腐病，在生產(chǎn)上可以采用不同種類瓜菜進(jìn)行輪作，在茬口安排上西葫蘆不可與黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物輪作，可以與茄科作物、十字花科作物輪作，以減輕腐皮鐮刀菌根腐病的危害。